乌梅丸方对溃疡性结肠炎大鼠结肠上皮细胞凋亡的影响*

闫曙光，惠 毅，李京涛

(1.陕西中医药大学，陕西咸阳 712046;2.陕西省胃肠病证方药重点研究室，陕西咸阳 712046)

乌梅丸方对溃疡性结肠炎大鼠结肠上皮细胞凋亡的影响*

闫曙光1，2，惠 毅1，李京涛1

(1.陕西中医药大学，陕西咸阳 712046;2.陕西省胃肠病证方药重点研究室，陕西咸阳 712046)

目的:探讨乌梅丸方对溃疡性结肠炎大鼠结肠上皮细胞凋亡的影响。方法:SD大鼠用TNBS/乙醇灌肠诱导形成溃疡性结肠炎，灌胃乌梅丸水煎剂，Q-PCR法检测各组大鼠结肠上皮组织Fas、FasL表达，ELISA法检测结肠上皮组织Caspase-3的表达，HE染色观察大鼠结肠病理组织学变化。结果:与空白组比较，模型组大鼠结肠上皮细胞Fas、FasLmRNA表达、Caspase-3含量显著升高;与模型组比较，乌梅丸大、中、小剂量组大鼠结肠上皮细胞Fas、FasLmRNA表达、Caspase-3含量显著降低;与乌梅丸大剂量组比较，乌梅丸中、小剂量组大鼠结肠上皮细胞Fas、FasLmRNA表达、Caspase-3含量显著升高。结论:乌梅丸可通过抑制结肠上皮细胞的过度凋亡对溃疡性结肠炎起治疗作用，以大剂量组疗效最佳。

溃疡性结肠炎;乌梅丸;细胞凋亡

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是以腹痛、黏液脓血便为主要临床表现的难治性疾病，病情可反复发作、迁延不愈，是结肠肿瘤的主要诱因之一［1］。病理组织学研究表明，肠黏膜屏障的持续损伤是溃疡性结肠炎的核心病变［2］。肠黏膜屏障具有肠道保持完整性和抵御外源性微生物侵袭的重要作用，分为物理屏障和化学屏障。结肠上皮细胞既是物理屏障的组成部分，其所分泌黏蛋白、防卫素等多肽抗菌素又构成了化学屏障，由此可见，上皮细胞是结肠黏膜发挥屏障作用的关键。进一步的研究表明，结肠黏膜屏障损伤的主要原因是由于结肠上皮细胞的过度凋亡引起的数量减少，其物理屏障和化学屏障功能失常，最终导致溃疡性结肠炎的发生［3］。因此，抑制结肠上皮细胞的过度凋亡为溃疡性结肠炎的治疗提供了新的思路。乌梅丸是《伤寒论》中治疗“久泻、久利”的经方，为历代医家所推崇，治疗溃疡性结肠炎疗效确切［4］。药理研究表明，该方可通过抗炎、止泻、止痛等途径对UC发挥治疗作用［5］。基于细胞凋亡在溃疡性结肠炎治疗中的作用以及乌梅丸的良好疗效，课题组开展了乌梅丸方对UC大鼠结肠上皮细胞凋亡影响的研究，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SD雄性大鼠50只，体质量(220 g±20)g，由西安交通大学医学实验动物中心提供(许可证号SCXK(陕)2012-003)，动物饲养于陕西中医药大学医学科研实验中心。

1.1.2 药物 乌梅丸方［5］组成:乌梅16 g，人参6 g，当归4 g，干姜10 g，细辛6 g，桂枝6 g，附子6 g，蜀椒4 g，黄连16 g，黄柏6 g，以上药物除附子、细辛外均加水浸泡，附子、细辛先煎30 min，余常规煎煮、浓缩后4℃冰箱保存备用。中药饮片购于陕西兴盛德中药有限公司，经我校中药教研室鉴定合格。

1.1.3 主要试剂 2，4，6-三硝基苯磺酸TNBS (批号0002508192)，美国SIGMA公司;RNA提取试剂盒、cDNA合成试剂盒、Q-PCR SuperMix(批号分别为I20123，H51028，H41129)，北京全式金生物技术有限公司;引物设计与合成(批号见表1)，南京金斯瑞生物科技有限公司;Caspase-3 ELISA检测试剂盒(批号201407)，武汉伊莱瑞特生物技术有限公司。

1.1.4 主要仪器 NANODROP2000C型核酸测定仪，Thermo(美国)公司;ELX808型酶标仪，美国博腾公司;EDC-810型PCR仪，北京东胜创新生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分组及造模 大鼠称重后，按随机数字表法分为空白组、模型组、乌梅丸大、中、小剂量组5组各组10只。除空白组外，余禁食24 h后水合氯醛麻醉，用直径2.0 mm的硅胶管由肛门轻缓插入约6～8 cm处，将50%的TNBS/乙醇溶液按100 mg ·kg－1剂量缓慢注入结肠，大鼠倒置30 s，诱导溃疡性结肠炎形成［6］。造模8 h后开始灌胃给药，给药剂量参照前期研究结果［7］:乌梅丸小剂量组13.3 g· kg－1，中剂量组 26.6 g·kg－1，大剂量组 53.2 g· kg－1，空白组、模型组均给予生理盐水10 ml·kg－1，以上各组每日灌胃1次，连续10 d。

1.2.2 结肠组织病理学观察 取距大鼠肛门6～8 cm间约0.5 cm结肠组织，10%甲醛固定，梯度酒精脱水、石蜡包埋、切片，HE染色观察结肠病理组织学变化。

1.2.3 结肠上皮细胞Caspase-3的检测 取距大鼠肛门6～8 cm间0.5 cm结肠段，刮取黏膜制成组织匀浆，ELISA法检测结肠黏膜Caspase-3的含量，具体实验步骤按试剂盒说明书进行。

1.2.4 结肠上皮细胞织Fas、FasL表达的检测 表1显示，取距大鼠肛门6～8 cm间约1 cm结肠段，生理盐水清洗刮取黏膜层，置于EP管中，加入约1 ml组织裂解液制成组织匀浆，按RNA提取试剂盒所列步骤提取总RNA。取2 μL总RNA按照反转录试剂盒说明合成cDNA，合成后测定cDNA浓度备用。Q-PCR法检测mRNA表达，PCR采用20 μL反应体系［10］:PCR Mix 10 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA体积依据浓度添加，加灭菌蒸馏水补足至20 μL;反应条件:94℃预变性5 min;94℃变性30 s; 57℃退火45 s;72℃延伸40 s;共40～45个循环，72℃终末延伸10 min。

1.2.5 统计学方法 采用SPSS 18.0统计软件进行统计分析，数据以均数±标准差(±s)表示，采用单因素方差分析进行多组间比较，2组比较采用LSD和SNK法，P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 PCR引物序列及批号

2 结果

2.1 乌梅丸方对溃疡性结肠炎大鼠结肠组织病理学变化的影响。

图1显示，空白组大鼠结肠上皮组织结构完整，界限清晰，结肠黏膜表面光滑，腺体排列整齐有序，未见炎症细胞浸润、出血等病理改变。模型组大鼠结肠黏膜大面积缺损，有大量炎性细胞浸润，腺体排列紊乱甚至萎缩或消失，杯状细胞数目明显减少，甚至可见黏膜下层炎症和出血，为典型的溃疡性结肠炎病理组织学表现。经给药治疗后，乌梅丸大、中剂量组大鼠结肠黏膜仍可见炎性细胞浸润，但腺体排烈紊乱明显减少，黏膜缺损面减小，黏膜下层炎症和出血明显减少;乌梅丸小剂量组大鼠仍可见大量炎性细胞浸润，甚至达黏膜下层，大片黏膜缺损或坏死，表面不平，腺体结构不完整，杯状细胞数目减少。

图1 各组大鼠结肠病理组织学观察(HE染色，×50)

2.2 乌梅丸方对溃疡性结肠炎大鼠结肠上皮细胞Fas、FasLmRNA和Caspase-3表达的影响。

表2显示，与空白组比较，模型组大鼠结肠上皮细胞Fas、FasLmRNA和Caspase-3表达显著增强(P＜0.01)，表明造模后，结肠上皮细胞Fas和FasL蛋白结合增强，激活下游Caspase-3蛋白，诱发结肠上皮细胞过度凋亡，引起黏膜屏障功能降低，加重黏膜损伤;给药治疗后与模型组比较，乌梅丸大、中、小剂量组大鼠结肠上皮细胞Fas、FasLmRNA表达显著减弱，Caspase-3表达显著降低(P＜0.01)，表明乌梅丸能有效抑制结肠上皮细胞的过度凋亡，促进黏膜屏障功能和受损黏膜的恢复，对溃疡性结肠炎发挥了治疗作用;各给药组间比较，大鼠结肠上皮细胞Fas、FasLmRNA和Caspase-3的表达差异有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)，其中大剂量组最低，中剂量组次之，小剂量组最高，表明乌梅丸抑制结肠上皮细胞凋亡的作用与剂量成正比关系。

3 讨论

细胞凋亡是指在一定的生理或病理条件下，细胞接受刺激信号后的一种自主的、由凋亡相关基因控制的细胞程序性死亡方式，生理状态下的细胞凋亡有助于维持内环境的稳定，病理状态下的凋亡则会引起自体损伤［7］。当溃疡性结肠炎发生时，结肠上皮细胞凋亡增多，在UC炎症活动区域，正在分化的结肠上皮细胞通过凋亡大量提前死亡导致UC结肠上皮的物理屏障和化学屏障功能破坏，导致结肠黏膜的损伤并最终形成溃疡面，因此抑制结肠上皮细胞的过度凋亡、修复受损的黏膜组织成为目前溃疡性结肠炎治疗的研究热点之一［3］。多项研究表明，Caspase-3、Fas和FasL是控制结肠上皮细胞凋亡的主要基因［8］。Caspase-3属于Caspase超家族成员，是控制细胞凋亡的基因之一，一旦Caspase-3被激活细胞凋亡将会不可逆地进行下去，因此Caspase-3被认为是细胞凋亡的重要标志［9］。Fas是属于肿瘤坏死因子受体超家族成员的一种跨膜蛋白，它与其配体FasL结合后会启动凋亡信号并最终引起细胞凋亡。严瑾［10］等研究证实，在溃疡性结肠炎结肠上皮细胞的凋亡过程中，Fas/FasL配体所介导的信号通路发挥了关键作用，通过检测Fas/FasL的表达也许可作为预示UC疾病活动性的重要指标。综上所述，针对 Caspase-3、Fas/ FasL这条信号通路予以阻断，为UC的治疗提供了新的机制［11］。

表2 各组大鼠结肠上皮细胞Fas、FasLmRNA、Caspase-3表达比较(±s)

表2 各组大鼠结肠上皮细胞Fas、FasLmRNA、Caspase-3表达比较(±s)

注:与空白组比较:＊＊P＜0.01;与模型组比较:#P＜0.05，##P＜0.01;与乌梅丸大剂量组比较:▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

组别 鼠数 剂量g·kg－1 Fas(mRNA) FasL(mRNA) Caspase-3(ng·ml－1)空 白 组 10 —1.05±0.04 1.06±0.04 1.78±0.05模 型 组 10 — 1.91±0.07＊＊ 1.87±0.08＊＊ 2.24±0.07＊＊乌梅丸大剂量组 10 53.2 1.38±0.04## 1.45±0.02## 1.89±0.05##乌梅丸中剂量组 10 26.6 1.44±0.03##▲ 1.54±0.04##▲ 1.99±0.08##▲乌梅丸小剂量组 10 13.3 1.64±0.04##▲▲ 1.63±0.03##▲▲ 2.12±0.06#▲▲

乌梅丸在《伤寒论》中不仅治疗蛔厥，还能治疗“久泻、久利”，后世医家据此将乌梅丸列入治疗痢疾、泄泻等疾病的方剂中，用于治疗下利类疾病。如《千金方》中载其能治“久痢，诸药不瘥数十年者，消谷下气，补虚，暴痢，冷痢久下”，《外台秘要》中用其治疗“冷痢久下”，《普济方》中用治“诸痢久下”，《医宗金鉴》记载该方治“久痢脏有寒热不分”。溃疡性结肠炎是现代医学病名，属于中医学“下利，痢疾”范畴，因溃疡性结肠炎疾病的发展是一个动态变化的过程，临床表现中有虚实寒热等不同，但其发病过程可见由实而虚、由表及里、由轻到重的过程，其病机多为虚实寒热错杂。乌梅丸具有清热燥湿、温中散寒、补益气血、收敛固涩的功效，正对溃疡性结肠炎虚实寒热错杂的病机，故临床疗效显著，但目前缺少该方的相关实验研究，其具体作用机制尚不十分明确。本次实验研究表明，乌梅丸方能降低结肠上皮Caspase-3蛋白的表达，降低结肠上皮细胞Fas和FasL mRNA的过度表达，从而抑制结肠上皮细胞的过度凋亡，促进结肠黏膜屏障的修复，对溃疡性结肠炎发挥治疗作用，这可能是该方的作用机制之一。各治疗组间比较结果表明，乌梅丸抑制结肠上皮细胞过度凋亡的作用与剂量成正比。乌梅丸是传统经方，其药物组成复杂，体现了多种治法的综合。本次研究只是从细胞凋亡的角度对该方的作用机制进行了初步探索，其具体的作用机制还需更加深入的研究。

［1］Foersch S，Waldner MJ，Neurath MF.Colitis and colorectal cancer［J］.Dig Dis，2012，30(5):469-476.

［2］Seidelin JB，Nielsen OH.Epithelialapoptosis: cause or consequence of ulcerative colitis［J］.Scand J Gastroenterol，2009，44(12):1429-1434.

［3］李莉，吕春艳，张春艳，等.溃疡性结肠炎上皮细胞增殖与凋亡观察分析［J］.中国误诊学杂志，2007，21(7):5000-5001

［4］闫曙光，惠毅，周永学，等.乌梅丸方加减治疗溃疡性结肠炎的疗效评价与Meta分析［J］.中国中医基础医学杂志，2013，19(3):296-298.

［5］闫曙光，惠毅，周永学.乌梅丸及其拆方的镇痛作用［J］.中国实验方剂学杂志，2013，19(21):262-265.

［7］Min Zhang，Yin Long，Yang Sun.Evidence for the complementary and synergistic effects of the three-alkaloid combination regimen containing berberine，hypaconitine and skimmianine on the ulcerative colitis rats induced by tri-nitro benzene-sulfonic acid［J］.Eur J Pharmacol，2011，651(3):187-196.

［8］惠毅，闫曙光.乌梅丸拆方对UC大鼠结肠上皮细胞Notch信号通路的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2015，21(7): 114-117.

［9］Buczyński J，Spychalski M，awska-Wierzchniewska A，et al.Higher apoptosis index and proliferation index in colonocytes of patients with ulcerative colitis in remission［J］.Pol Przegl Chir，2012，84(6):271-275.

［9］Jones SA，Butler RN，Sanderson IR，et al.The effect of specific caspase inhibitors on TNF-Alpha and butyrate-induced apoptosis of intestinal epithelial cells［J］.Exp Cell Res，2004，292:29-39.

［10］严瑾，欧阳钦，陈代云.溃疡性结肠炎中Fas/FasL介导的结肠上皮细胞凋亡［J］.中华消化杂志，2001，21(7):397-399.

［11］王志鹏，张蓉，刘莉，等.大黄多糖对溃疡性结肠炎小鼠结肠上皮细胞和外周血中性粒细胞凋亡的影响［J］.世界华人消化杂志，2006，14(1):29-34.

Effect of Wumei Pill on Apoptosis of Colonic Epithelial Cells in Rats with Ulcerative Colitis

YAN Shu-guang1，2，HUI Yi1，Li Jing-tao1
(1.Shaanxi university of TCM，Shaanxi Xianyang 712046，China;2.Shaanxi gastrointestinal disease and syndrome formulae key laboratory，Shaanxi Xianyang 712046，China)

Objective:To observe the effect of Wumei Pill in colonic epithelial cell apoptosis of ulcerative colitis rats.Methods:Selecting male SD rats and establishing ulcerative colitis model.All the rats except blank group were given Wumei Pill or its Subdivisions，then test the Fas、FasL expressions by Q-PCR method and Caspase-3 expressions in Q-PCR method of rats’colonic tissue.Results:Compared with blank group，Fas，FasL，Caspase-3 expression were statistically significant in model group rats.Compared with model group，there were statistically significant in Wumei Pill high，middle and low groups.Compared with Wumei Pill high groups，there was statistically significant in Wumei Pill middle and low groups.Conclusion:Wumei Pill has therapeutic effect on ulcerative colitis through inhibiting the excessive apoptosis of colon epithelial cells，and the therapeutic effect of Wumei Pill high groups is better than that of middle and low groups.

Ulcerative colitis;Wumei Pill;Cell apoptosis

R285.5

B

1006-3250(2016)06-0771-03

2015-12-16

陕西省中医药管理局项目(13-jc020)-基于细胞凋亡研究乌梅丸及拆方治疗溃疡性结肠炎的作用机制;陕西省科技厅项目(2013JQ4006)-乌梅丸拆方对UC大鼠结肠上皮细胞和PMN凋亡的影响

闫曙光(1981-)，男，陕西户县人，讲师，医学博士，从事中医药消化系统疾病的临床与实验研究。