LASIK术中瞬时高眼压对兔视网膜组织NO含量及NOS活性的影响

关文英，赵海霞，王召格，葛瑞春，王瑞芳

(内蒙古医科大学附属医院，呼和浩特010050)



LASIK术中瞬时高眼压对兔视网膜组织NO含量及NOS活性的影响

关文英，赵海霞，王召格，葛瑞春，王瑞芳

(内蒙古医科大学附属医院，呼和浩特010050)

摘要：目的观察准分子激光原位角膜磨镶术(LASIK)术中不同持续时间的负压吸引引起的瞬时高眼压对视网膜组织NO含量及一氧化氮合酶(NOS)活性的影响，探讨LASIK术中负压吸引安全时间。方法将实验用68只新西兰大耳白兔随机分为五组。负压吸引20 s组(n=20)、负压吸引45 s组(n=20)和负压吸引3 min组(n=20)模拟LASIK手术过程，负压吸引时间分别持续20 s、45 s及3 min；实验对照组(n=4)仅行单眼原位角膜激光消融，正常对照组(n=4)不进行任何处理。各负压吸引组分别于术后即刻、7天、10天、14天、28天各处死动物4只，实验对照组于激光消融后处死动物，同时处死正常对照组动物。采用752型分光光度计测各组视网膜组织NO含量及NOS活性。结果NO含量及NOS活性：实验对照组与正常对照组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；负压吸引20 s组、45 s组术后各时点与正常对照组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。负压吸引3 min组术后即刻与正常对照组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，术后7天、10天高于正常对照组(P均<0.05)，术后14天、28天与正常对照组比较差异无统计学意义(P均>0.05)；术后7天NO含量及NOS活性达高峰，二者表达呈正相关(r=0.982，P<0.05)。结论LASIK术中常规负压吸引20 s、45 s不会导致视网膜组织NO含量及NOS活性改变；负压吸引时间延长至3 min可引起视网膜组织NO含量及NOS活性升高，但这种改变是可逆性的，术后修复28天基本恢复正常。

关键词：准分子激光原位角膜磨镶术；一氧化氮；一氧化氮合成酶；兔

准分子激光原位角膜磨镶术(LASIK)是目前矫正屈光不正最常用的方法[1]。研究发现，LASIK术中负压吸引时患者视神经乳头及网膜视神经节细胞可发生明显的形态学改变，瞬时髙眼压可引起视网膜瞬间缺血再灌注损伤，其对视网膜功能的影响与髙眼压持续时间有关[2,3]。缺血再灌注损伤过程中，NO与一氧化氮合成酶(NOS)在视网膜神经节细胞(RGC)的凋亡中起关键作用[4~6]。2009年9月~2010年3月我们观察了LASIK术中瞬时高眼压对兔视网膜组织凋亡相关因子NO含量及NOS活性的影响，旨在为屈光不正患者的手术治疗提供依据。

1材料与方法

1.1材料健康无眼疾的新西兰大耳白兔68只，体质量3～4 kg，雌雄不限，均购自内蒙古医科大学动物实验中心，室温环境饲养。负压发生器(MoriaⅡ负压发生器，法国Moria公司)；准分子激光治疗仪(SVS Apex，德国舒荣公司)。速眠新注射液(军事医学科学院军事兽医研究所)；地卡因(内蒙古医学院附属医院制剂室)；氯霉素滴眼液(沧州光明药业有限公司)；涂典必殊眼膏(德国爱尔康公司)。NO试剂盒及NOS试剂盒(南京建成科技有限公司)。

1.2实验分组与造模将68只兔随机分正常对照组(n=4)、实验对照组(n=4)、负压吸引20 s组(n=20)、负压吸引45 s组(n=20)、负压吸引3 min组(n=20)。各负压吸引组模拟LASIK手术全过程(双眼为实验眼)，在LASIK中使用MoriaⅡ负压发生器，用负压吸引环置于兔角巩膜缘制作瞬时高眼压模型。术前用速眠新注射液0.2~0.4 mL/kg麻醉，术时用0.5%地卡因行表面麻醉后置开睑器。将负压发生器置于兔眼角巩膜缘，监测眼压，证实瞬时高眼压(65 mmHg左右)存在。负压吸引20 s组、负压吸引45 s组、负压吸引3 min组负压吸引分别持续20 s、45 s和3 min，然后角膜微型刀PTK去除角膜上皮(切削直径6.5 mm，深度50 μm)。角膜基质按照-9.00D进行准分子激光消融(消融直径6.5 mm，深度127 μm)，激光波长193 nm，能量密度125 mJ/cm2，脉冲频率10 Hz。实验对照组仅行单眼原位角膜激光消融，不行负压吸引。术后实验对照组及负压吸引组均滴抗生素眼药水，涂妥布霉素地塞米松眼膏预防感染。以上操作由同一手术医师完成。正常对照组取双眼为实验眼，不进行任何处理。

1.3视网膜组织NO含量及NOS活性检测术后即刻正常对照组、实验对照组均处死动物， 各负压吸引组分别于术后即刻、术后7天、10天、14天及28天采用空气栓塞法各处死动物4只。迅速取出眼球，冰盐水洗去血污，将眼球迅速放在生理盐水浸湿的无菌纱布上，在超净工作台内在上直肌缝线定位，角巩膜缘处剪去角膜，去除虹膜和晶体，尽可能取净玻璃体后用眼科显微钩镊迅速分离视网膜，视网膜组织置于EP管中，称重后直接放入-80 ℃冰箱中保存。检测时将EP管中视网膜组织研碎，使组织匀浆化并离心，取上清液。采用752型分光光度计各组视网膜组织NO含量及NOS活性：NO含量=(测定管吸光度-空白管吸光度)÷(标准管吸光度-空白管吸光度)×标准品浓度÷标本的蛋白含量；总NOS活性=[(总NOS测定管OD值-空白管OD值)÷呈色物纳摩尔消光系数]×(反应液总体积÷取样量)×[1÷(比色光径×反应时间)]÷蛋白含量； 蛋白含量=(测定管OD值-空白管OD值)÷(标准管OD值-空白管OD值)×标准管浓度。分析负压吸引3 min组术后各时点视网膜组织中NO含量与NOS活性的相关性。

2结果

各组视网膜组织NO含量和NOS活性比较见表1。负压吸引3 min组术后各时点视网膜组织NO含量与NOS活性呈正相关性(r=0.982，P<0.05)。

3讨论

准分子激光是一种超紫外线光波，波长193 nm， 产生的热-声波能量非常小，传导到视网膜、玻璃体等眼后段时的光能量极小，不会引起视网膜及视神经损害。 本研究前期证实，激光治疗本身对视网膜组织NO含量及NOS活性无明显影响。 但LASIK中需行巩膜负压吸引环吸引角巩膜缘制作板层角膜瓣，在负压吸引以及微型角膜刀运行过程中，眼内压瞬时可达65 mmHg左右，眼压瞬时升高对眼组织结构和功能的影响一直是临床关注的问题。

表1　各组视网膜组织NO含量和NOS活性比较±s)

注：与其他组及同组其他时间点比较，*P<0.05，△P<0.01。

Huxtable[7]和Tsai等[8]发现，LASIK后1个月患者的视神经纤维层(RNFL)厚度明显变薄。Lee等[9]在报道LASIK中负压为128～141 mmHg，眼内压最低为65 mmHg，负压持续时间为45 s，患者分别于术后1天、3天和数天内出现了不同程度的视神经缺血症状，伴有视力下降和视野缺损。目前在应用飞秒激光技术矫正屈光不正的手术中，其负压吸引的时间较长，可能会达到或超过3 min。本课题组前期动物实验证实，术中负压吸引造成眼压的骤升骤降会引起视网膜瞬时缺血再灌注损伤，视网膜结构和功能出现可逆性变化。LASIK负压吸引导致上述可逆性改变的机制以及负压吸引的安全时间是目前研究的热点[10,11]。

NO是一个活跃的化学分子，为内源性短效反应气体，能溶于组织且能自由地通过细胞膜[12]。NO为重要的细胞内信使，广泛参与体内多种生理、病理过程。大量的NO可导致毒性自由基产生，进而引起细胞凋亡。关于NO细胞凋亡机制有很多报道，NO引发凋亡的启动方式在不同生物的细胞中不同，通常情况下NO通过线粒体介导的途径引起细胞凋亡，线粒体通路是凋亡的主要通路。

研究证实，NOS可催化NO的合成，在组织内将底物L-精氨酸胍基氧化，释放NO，同时生成L-瓜氨酸[13]。结膜上皮、角膜上皮及内皮，虹膜和睫状体上皮、虹膜括约肌、睫状肌、小梁网、巩膜静脉窦、集合管内皮、晶状体内均含有NOS Ⅲ，具有扩张血管、增加血管通透性、调节眼压等作用；而睫状体上皮细胞、视网膜、视乳头等部位含有丰富的NOSⅠ，与眼压调节、视觉形成与传导有关；虹膜睫状体、视网膜、脉络膜等组织在内毒素和细胞因子的刺激下均能增强NOSⅡ的表达，与各种眼内炎症，神经元细胞毒性，免疫介导和血流调节等作用有关[14]。

正常细胞和组织可以对体内外环境变化等的持续性刺激作出形态、功能和代谢的反应性调整和适应，若上述刺激超过了细胞和组织的耐受与适应能力，则引起细胞及其间质的物质代谢、组织化学、超微结构乃至光镜和肉眼可见的异常变化。LASIK中负压吸引环长时间压迫眼球，高眼压长时间持续，可对视神经和视网膜造成瞬时缺血再灌注损伤[15]。视网膜缺血时，组织生成缓激肽、乙酰胆碱、组织胺等物质增多，局部血管内皮细胞在这些刺激因素的作用下生成NOS增多，通过内皮细胞左旋精氨酸-NO通路合成NO。大量NO可能导致毒性自由基形成，造成再灌注损伤。

本研究结果显示，单纯激光治疗不会影响视网膜组织中NO含量及NOS活性；负压吸引20 s组、45 s组视网膜组织NO含量及NOS活力与正常对照组比较差异无统计学意义，表明LASIK术中负压吸引20~45 s是安全的；负压吸引3 min组视网膜组织NO含量及NOS活性术后即刻与正常对照组比较差异无统计学意义，术后7天、10天明显高于正常对照组，术后7天达到高峰，术后14天、28天与正常对照组比较差异无统计学意义，至术后28天基本恢复正常。表明负压吸引时间延长(3 min)，NO含量及NOS活性明显升高，但经过一定时间的修复可以恢复，即上述改变是可逆的。

综上所述，LASIK术中眼压急剧升高可引起视网膜组织NO含量及NOS活性可逆性增高。且长时间持续的负压吸引可引起NO含量及NOS活性明显增高。术中短时间(45 s以下)负压吸引不影响或仅轻微影响视网膜组织中NO含量及NOS活性。负压吸引时间延长(3 min)，NO含量及NOS活性明显升高，但经过一定时间的修复可以恢复，即上述改变是可逆的。尽管LASIK术中瞬时负压吸引是安全的，但术中仍应尽量使用自动和手动旋转角膜刀，在保证成功完成角膜瓣制作的同时，缩短负压吸引的时间，确保手术安全。

参考文献：

[1] Guell JL, Muler A. Laseer in situ keratomileusis(LASIK) for myopia form -7 to -8 diopters[J]. J Refract Surg, 1996,12(2):222-228.

[2] Piette S, Liebmann JM, Ishikawa H, et al. Acute conformational changes in the optic nerve head with rapid intraocular pressure elevation: implications for LASIK surgeoy[J]. Ophyahalmic Surg Lasers Imaging, 2003,34(4):334-341.

[3] Chintalt SK. The emerging role of proteases I retinal ganglion cell death[J]. Exp Eye Res, 2006,82(1):5-12.

[4] 赵海霞,黄一飞,陆蓓,等.LASIK术中瞬时高眼压对视网膜超微结构的实验研究[J].眼科研究,2007,25(10):725-728.

[5] Afolayan AJ, Eis A, Alexander M, et al. Decreased Endothelial NOS Expression and Function Contributes to Impaired Mitochondrial Biogenesis and Oxidative Stress in Fetal Lambs with PPHN[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2015. Epub ahead of print.

[6] Oku H, Morishita S, Horie T, et al. Nitric Oxide Increases the Expression of Aquaporin-4 Protein in Rat Optic Nerve Astrocytes through the Cyclic Guanosine Monophosphate/Protein Kinase G Pathway[J]. Ophthalmic Res, 2015,54(4):212-221.

[7] Huxtable RJ. Taurine in the central nervous system and the mammalian actions of taurine[J]. Prog Neurobiol, 1989,32(6):471-533.

[8] Tasi JC, Wu L, Worgul B, et al. Intravitreal administration of erythropoietin and preservation of retinal gaglion cells in an experimental rat model of glaucoma[J]. Curr Eye Res, 2005, 30(11):1025-1031.

[9] Lee AG, Kohnen T, Ebner R, et al. Optic neuropathy associated with laser in situ keratomileusis[J]. J Cataract Refract Surg, 2000,26(11):1581-1584.

[10] 赵海霞,黄一飞,陆蓓,等.LASIK术中瞬时高眼压对兔视网膜功能影响的研究[J].眼科新进展,2008,28(5):323-326.

[11] 赵海霞,黄一飞,杨惠英，等.负压吸引对视网膜组织结构的影响[J].中国康复理论与实践,2005,11(5):349-351.

[12] 邓娟,吴德正.一氧化氮与眼底病相关研究的新进展[J].中华眼底病杂志,1998,14(1):59-61.

[13] Toni M, De Angelis F, di Patti MC, et al. Nitric Oxide Synthase in the Central Nervous System and Peripheral Organs of Stramonita haemastoma: Protein Distribution and Gene Expression in Response to Thermal Stress[J]. Mar Drugs, 2015,13(11):6636-6664.

[14] Chiou GC. Review: Effeets of nitric oxide on eye diseases and their treatment[J]. J Ocul Pharmaeol Ther, 2001,17(2):189-198.

[15] Bushley DM, Parmley VC, Paglen P. Visual field defect associated with laser in situ keratomileusis[J]. Am J Ophthalmol, 2000,129(5):668-671.

Effects of transient high intraocular pressure during LASIK on NO and NOS activity in retinal tissues

GUANWenying,ZHAOHaixia,WANGZhaoge,GERuichun,WANGRuifang

(TheAffiliatedHospitalofInnerMongoliaMedicalUniversity,Huhhot010050,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the effects of transient high intraocular pressure (IOP) caused by negative pressure suction at different time of duration during laser-assisted in situ keratomileusis (LASIK) on the changes of NO and NOS in retinal tissues and to investigate the safe time of negative pressure suction during LASIK. MethodsSixteen-eight New Zealand white rabbits were randomly divided into the normal control group (n=4), the experimental control group (n=4), 20 s suction group (n=20), 45 s suction group (n=20) and 3 min suction group (n=20), whose time of negative pressure suction was respectively 20 s, 45 s and 3 min. LASIK surgical procedure was simulated, and the experimental control group only received laser ablation and the normal control group without any treatment. The animals in the suction groups were executed immediately (0 d), after 7 d, 10 d, 14 d and 28 d. The rabbits in the experimental control group were executed after laser ablation. Meanwhile, the rabbits in the normal control group were executed. The NO content and NOS activity in retinal tissue of each group were detected by 752 spectrophotometer. ResultsNO content and NOS activity: no significant difference was found between the normal control group and the experimental control group (all P>0.05), no significant difference was found at every postoperative time between the 20 s suction group, 45 s suction group and normal control group (all P>0.05), no statistically significant difference was found between the 3 min suction group and the normal control group immediately after operation (all P>0.05). Seven days and 10 day after operation, the NO content and NOS activity in the 3 min suction group were higher than those of the normal control group (all P<0.05). No significant difference in the NO content and NOS activity was found between the 3 min suction group and the normal control group 14 days and 28 days after operation (all P>0.05). The NO content and NOS activity reached a peak 7 d after operation, and they were positively correlated with each other (r=0.982， P<0.05). ConclusionsConventional suction of 20 s and 45 s in LASIK does not cause the change of NO content and NOS activity in the retinal tissues. When the suction time extends to 3 min, the NO content and NOS activity, but this change is reversible increase, after 28-day restoration, it can return to normal.

Key words:laser-assisted in situ keratomileusis; nitric oxide; nitric oxide synthetase; rabbit

(收稿日期：2015-11-09)

中图分类号：R779.63

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)04-0012-04

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2016.04.004

通信作者简介：赵海霞(1968-)，女，博士，主任医师，教授，主要研究方向为角膜病、青光眼及眼视光学。E-mail: zhaohaixia@sohu.com

作者简介：第一关文英(1983-)，女，硕士，住院医师，主要研究方向为眼视光学。E-mail: yingzi830822@126.com

基金项目：国家自然科学基金资助项目(30660194)。