番茄含氮量快速检测微电极的研制

左志宇，骆　飞，毛罕平，马万征，张晓东，李青林，秦丽娟，吕天远

(江苏大学 现代农业装备与技术教育部重点实验室，江苏 镇江　212013)



番茄含氮量快速检测微电极的研制

左志宇，骆飞，毛罕平，马万征，张晓东，李青林，秦丽娟，吕天远

(江苏大学 现代农业装备与技术教育部重点实验室，江苏 镇江212013)

摘要：针对设施栽培番茄营养信息检测的需求，提出了一种基于多管离子选择性微电极的番茄含氮量快速检测方法。为此，详细讨论了多管离子选择性微电极的拉制、硅烷化、敏感剂充灌和标定等制备过程；通过对现有硝酸根离子和铵根离子敏感剂配方进行试验分析，筛选出了适用于多管离子选择性微电极的硝酸根离子和铵根离子敏感膜。通过番茄叶片样本测试，并与AA3连续流动分析仪测得的含氮量相比，采用多管离子选择性微电极测得的番茄叶片样本含氮量绝对误差为1.03mg/g,相对误差为3.96%。试验结果表明：采用多管硝酸根离子和铵根离子选择性微电极检测番茄叶片中的含氮量是可行的。该研究可为同时快速检测作物中钾、钙等离子的含量提供参考。

关键词：番茄；含氮量；多管离子选择性微电极；硝酸根离子；铵根离子

0引言

目前，我国设施园艺发展迅速，设施农业面积已超过380万hm2，居世界第一位。设施作物生产出产量大、需肥量多、土壤肥力消耗高，且不少温室、大棚采用无土栽培，容易出现营养元素比例失调或缺素等问题。因此，迫切需要在作物生长过程中对养分信息进行检测。

传统的作物营养元素检测方法主要是通过采集作物样本在实验室进行分析，需要破坏性采样，操作繁琐、耗时较长、分析结果实时性差，需要专业分析人员操作。离子选择性微电极进行作物营养检测，具有快速、准确、简便等特点，可以进行非破坏活体测量，正逐渐成为国内外作物营养诊断技术的热点。

20世纪50年代以来，离子选择性微电极开始被用来研究植物[1]；80年代开始研究将离子选择性微电极应用到植物营养养分分子，如NH4+[2]、N03-[3-4]、K+[5]等的吸收和再分配过程的研究中。离子选择性微电极在植物生理学领域中的应用主要包括快速灵敏获取活体植物营养运输信息[6-7]，获得微小区域不同离子微量的信息[8-10]，探测光诱导引起的与叶片生长有关的离子或分子信息[11-13]等。目前，离子选择性微电极主要检测单一离子浓度，不能同时检测多种营养离子的浓度，所以在出现多种营养成分亏缺时，难以判断作物营养亏缺的真实原因。

针对上述问题，本文提出了一种多管离子选择性微电极对作物中硝酸根和铵根离子同时进行检测的方法，并在典型设施栽培作物番茄的含氮量检测中进行了验证，实现了番茄含氮量的实时、快速、准确和非破坏活体测量。

1材料与方法

1.1仪器和测试方法

微电极信号放大器使用MultiClamp 700B膜片钳放大器(AXON公司美国)，工作于I=0模式；数据记录采用pCLAMP10软件；微电极夹持和定位采用MP-285微操纵器(SUTTER公司，美国)。

参比电极选用Ag/AgCl电极。硝酸根离子浓度测量电池为：(-)Ag|AgCl(s)|50mM KCl和50mM KNO3的混合溶液|硝酸根离子敏感膜‖待测溶液‖Ag+|Ag(+)。

铵根离子浓度测量电池为：(-)Ag|AgCl(s)|50mM KCl溶液|铵根离子敏感膜‖待测溶液‖Ag+|Ag(+)。所有测量都在室温(20～25℃)下的法拉第屏蔽网内进行。

1.2多管离子选择性微电极的制备

多管离子选择性微电极的制备包括敏感剂的配制、电极拉制、硅烷化，以及敏感剂、电极内充液的充灌等。

本文设计的多管离子选择性微电极由粘结在一起的3根轴向平行的微玻璃管组成。微玻璃管经拉制后，在其尖端分别灌充硝酸根、铵根离子敏感剂，然后分别灌入硝酸根离子、铵根离子、参比的内充液，每种内充液中分别插入1根信号线引出信号，用密封胶在微玻璃管的尾部进行密封，如图1所示。

1. 硝酸根离子敏感剂　2.铵根离子敏感剂　3.多管微玻璃管

1.2.1敏感剂的筛选

对国内外市场上已有的硝酸根离子、铵根离子敏感剂或离子敏感剂配方进行筛选，根据离子选择性、斜率、响应时间、重现性及稳定性等指标确定最适宜的离子选择性敏感膜。

从已公开发表的文献中选择了5种硝酸根离子敏感剂配方和6种铵根离子敏感剂配方，分别用A1-A5和B1-B5表示。其中，配方A1为Nitrate ionophore I-cocktail A(Sigma-Aldrich，美国)；配方B1为Ammonium ionophore I-cocktail A(Sigma-Aldrich，美国)。配方A2-A5组成如表1所示，配方B2-B6组成如表2所示。

1.2.2电极拉制

采用PMP107型可编程多管拉制仪(PMP-107，美国)的标准3管拉制程序，将1根3管玻璃管(Hilgenberg，德国)拉制成两根尖端直径为微米级的多管微电极。

表1　硝酸根敏感剂配方

表2　铵根根敏感剂配方

1.2.3微电极硅烷化

将拉制好的多管微电极置于精密鼓风干燥箱(BPG-9040A，中国)中，150℃下烘烤1h，除去残存在微电极内的水蒸气和杂质；将多管微电极放置在带盖的玻璃器皿中，放入3mL 5%的二甲基二氯硅烷(国药集团，上海)，使多管微电极浸泡30min，然后在150℃下继续烘烤，使二甲基二氯硅烷的蒸气进入和充分附在微电极的尖端，形成一层疏水层，以利于硝酸根和铵根离子敏感膜的形成和作用。硅烷化后，将去盖的玻璃器皿在150℃下烘烤，使过量的二甲基二氯硅烷蒸发掉。

1.2.4微电极的充灌

使用微量进样针将硝酸根离子敏感剂、铵根离子敏感剂从电极尾端缓慢推入微电极尖端;在显微镜下观察微电极内是否有气泡,若存在气泡，须将微电极尖端朝下放置一段时间，直至气泡完全从微电极中消失;然后在微电极管内分别充入相应的硝酸根离子内充液及铵根离子内充液。

1.3电极的标定

标准曲线法是离子选择性微电极最常用的一种分析方法。将充灌好的多离子选择性微电极分别放在配制的0.1M、0.01M、1.0mM、0.1mM、0.001mM的硝酸根离子和铵根离子标准溶液中，分别测定其电位，用以评价电极的响应范围、检测下限及斜率等性能指标。硝酸根离子标定液的组成参见文献[18]，铵离子标定液组成参见文献[16]。

2结果与分析

2.1多管离子选择性微电极的响应参数

测定了用不同离子敏感剂或离子敏感剂配方制成的离子选择性微电极，硝酸根离子选择性微电极在一系列硝酸根离子浓度为0.1M～0.001mM的标定溶液的标定曲线，如图2所示；响应参数如表3所示。铵根离子选择性微电极在一系列铵根离子浓度为0.1M～0.001mM的标定溶液的标定曲线，如图3所示；响应参数如表4所示。

图2　硝酸根离子选择性微电极标定曲线

从表3中对比可得，配方A1制成的敏感膜性能优于其它配方。因此，选取配方A1作为本研究的硝酸根离子敏感剂。

表3　硝酸根离子敏感剂在标定溶液中的响应参数

图3　铵根离子选择性微电极标定曲线

配方编号响应范围/M斜率/mV·(log[NH4+])-1检测下限/M响应时间/sB110-1～10-558.62010-58B210-1～10-451.39310-415B310-1～10-439.94710-450B410-1～10-433.50710-460B510-1～10-428.62310-475

从表4中对比可得，配方B1制成的敏感膜性能优于其它配方。因此，选取配方B1作为本研究的铵根离子敏感剂。

2.2多管离子选择性微电极的离子选择性

采用混合溶液法[19-20]测定了多管离子选择性微电极的选择性，如表5所示。表5中所有的阴离子均采用钠盐，所有的阳离子均采用氯化物。

从表5中可以发现:Br-对NO3-选择性微电极有一定干扰，但番茄作物中Br-含量较少，其影响可以忽略不计;K+对NH4+选择性微电极有轻微干扰。

表5　多管离子选择性微电极的选择性

2.3多管离子选择性微电极的稳定性

研制的多管离子选择性微电极，在室温下(温度波动在±2℃内)连续测量10h，当NO3-浓度为10-2M时候，电极电位波动在±1.5mV，相对误差为1.3%。

2.4多管离子选择性微电极的重现性

在室温下(温度波动±1℃)使用同一支多管离子选择性微电极对硝酸根、铵根离子浓度均为1mM的被测溶液进行重复测量，每天测试3次，每次连续测量4h，测试结果如表6所示。

表6　微电极的重现性

表6中的标准偏差值较小，说明研制的多管离子选择性微电极重现性较好。

2.5番茄氮素营养检测

采用所研制的多管离子选择性微电极对其设施栽培番茄叶片样本中NO3-及NH4+浓度进行测试，测得的NO3-和NH4+的离子敏感电极信号稳定后，其电压值分别为-103.84 mV和-16.53mV，如图4所示。根据NO3-和NH4+选择性微电极的标定曲线，计算出番茄叶片内NO3-和NH4+的浓度分别为0.20mmol/L和0.51mmol/L。根据文献[22]的方法转换成总氮质量比浓度，得番茄叶片中含氮量为25.00mg/g。

图4　多管离子选择性微电极信号记录图

采用文献[20]的方法对番茄叶片样本的总氮量进行检测，由AA3连续流动分析仪(SEAL，德国)测得番茄叶片样本中含氮量为26.03mg/g。

与采用AA3连续流动分析仪测得的含氮量相比，采用多管离子选择性微电极测得的番茄叶片中含氮量绝对误差为1.03mg/g,相对误差为3.96%。

3结论

筛选出的硝酸根离子选择性微电极和铵根离子选择性微电极组成的多管离子选择性微电极，有良好的离子选择性、重现性和稳定性。与采用AA3连续流动分析仪测量番茄叶片的含氮量相比，采用该方法测量的绝对误差为1.03mg/g,相对误差为3.96%。因此，采用该方法制作的多管离子选择性微电极检测番茄叶片中的含氮量是可行的。

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Development of Rapid Detection Microelectrode of Tomato Nitrogen Content

Zuo Zhiyu, Luo Fei, Mao Hanping, Ma Wanzheng, Zhang Xiaodong,Li Qinglin, Qin Lijuan, Lv Tianyuan

(Key Laboratory of Modern Agriculture Equipment and Technology, Ministry of Education, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China)

Abstract：To meet the requirement for nutrition information detection of tomato cultivated in protected agriculture, a method for rapid detection of tomato nitrogen content based on multibarrel ion selective microelectrode was proposed. The preparation process of drawn, silanization, sensitive agent filling, and calibration of multibarrel ion selective microelectrode were discussed in detail. Through test and analysis of the present sensitive formulation of NO3-and NH4+, the NO3-and NH4+sensitive membranes which are suitable for multibarrel ion selective microelectrode were screened. In comparison with the nitrogen content detected by AA3 continuous flow analyzer, the absolute error and the relative error for the nitrogen content of the tomato leaf sample are 1.03mg/g and 3.96%, respectively, through the test of tomato leaf sample by multibarrel ion selective microelectrode. The experimental results showed that: it is feasible to detect the nitrogen content of tomato leaf by the multibarrel NO3-ion and NH4+ion selective microelectrode. Besides, this study can provide a reference for detection of the content of potassium and calcium etc. of crops.

Key words：tomato; nitrogen content; multibarrel ion selective microelectrode; NO3-; NH4+

文章编号：1003-188X(2016)03-0174-05

中图分类号：S641.2;TP212.3

文献标识码：A

作者简介：左志宇(1977-)，男，湖南湘乡人，副教授，博士研究生，(E-mail)zuozy@ujs.edu.cn。通讯作者：毛罕平(1961-)，男，浙江宁波人，教授，博士，博士生导师，(E-mail) maohp@ujs．edu．cn。

基金项目：国家自然科学基金项目(31201659)；国家自然科学基金重点项目(61233006)；“十二五”国家科技支撑计划项目(2014BAD08B03)；安徽省科技攻关计划项目(1301031030)

收稿日期：2015-04-26