基于螺旋型铂铱合金电极的植入式葡萄糖生物传感器*

余江渊，朱志刚，陈　诚，李崭虹，陈云霞（.上海第二工业大学工学部环境与材料工程学院，上海20209；2.景德镇陶瓷学院材料科学与工程学院，江西景德镇33300）



基于螺旋型铂铱合金电极的植入式葡萄糖生物传感器*

余江渊1，2，朱志刚1*，陈诚1，李崭虹1，陈云霞2*
（1.上海第二工业大学工学部环境与材料工程学院，上海201209；2.景德镇陶瓷学院材料科学与工程学院，江西景德镇333001）

摘要：采用螺旋型铂铱合金电极设计，旨在提高植入式葡萄糖生物传感器的葡萄糖氧化酶担载量并增大工作电极的电化学活性面积。以扫描电镜（SEM）观察聚氨酯（Polyurethane，PU）半透膜的形貌，采用循环伏安法（CV）和计时电流法（I-T）考察PU涂覆厚度、PU含量以及酶含量等参数对传感器电化学性能的影响，结果表明：所制备的螺旋型传感器灵敏度在20 nA/(mmol/L)~ 30 nA/(mmol/L)，可在人体生理条件范围内线性检测（2 mmol/L~30 mmol/L）葡萄糖浓度，并且具有良好的重现性、稳定性和选择性，符合电极长期植入式需求，有望作为今后糖尿病患者血糖连续监测的关键器件。

关键词：葡萄糖生物传感器；螺旋线圈电极；聚氨酯半透膜；选择性

中国糖尿病患者有逐年上升的趋势，其中I型糖尿病患者总数在700万~1 000万之间，占到中国糖尿病患者总数的10%［1］。在全世界范围内，糖尿病已经成为失明、肾衰竭、手足坏死、心脏并发症等病变的主要原因，世界卫生组织估计，到2025年，糖尿病费用占全球卫生预算的比例将高达13%左右［2］。葡萄糖生物传感器作为检测血糖浓度以及诊疗糖尿病的重要工具，在全球有着巨大市场，其在2010年销售额超过100亿美金，并且逐年增长［3］。目前，糖尿病患者主要采用第2代手持式血糖仪进行个人检测，II型糖尿病人每天至少需要测2次，I型糖尿病人每天需要检测4次来判断血糖的波动趋势，这种方式相对简便、廉价，但无法掌控血糖波动变化规律，特别是不可预测由低血糖昏迷导致的患者死亡。因此，对糖尿病患者血糖浓度进行连续监测被国际学术界普遍认为是最佳诊疗方式，特别适合对胰岛素严重依赖的I型糖尿病患者［4-5］。

目前研究以及市场上出售的微创型传感器主要是针式（Needle type）器型［5-6］，这种器型设计的优点是创伤小、可以最大限度地减少器件植入生物体后出现的纤维包膜问题，但缺点也显而易见：葡萄糖氧化酶（GOD）只能薄薄地沉积在管壁周围，导致此类传感器使用周期较短（小于一周）。为了解决GOD担载低的现状，Medtronic公司曾经报道了基于MEMS工艺的硅基多孔道微结构，用于担载大量GOD，并且每个孔道都可以独立使用，起到一种缓释效果来延长传感器使用寿命。即使这款传感器的设计参数没有公开，但作者认为该技术成本过高，且硅片器件易对植入创口周围组织产生损伤。

螺旋型铂铱合金电极最早由美国Moussy教授课题组提出，采用螺旋型铂铱合金电极来担载GOD，与上述针式结构相比，该器型螺旋孔道结构可以担载更多酶，可以延长了器件植入后的使用寿命［7-8］。本论文的重点是对螺旋型铂金电极进行优化，通过研究不同酶配方、滴涂厚度以及不同PU含量对传感器的稳定性、使用重复性的影响，以期待获得性能最佳的植入式葡萄糖生物传感器。

1　实验

1.1实验试剂

葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase，GOD）、牛血清蛋白（Bovine serum protein，BSA）、戊二醛（Glutaral⁃dehyde，GA）、聚氨酯（PU）、抗坏血酸（Ascorbic acid，AA）、尿酸（Uric acid，UA）、四氢呋喃（Tetrahydrofu⁃ran，THF）、十二烷基聚四氧乙烯醚（Brij30）、双组份环氧胶粘剂（Epoxy）等化学试剂均从Sigma-aldrich公司购得，实验用水为18 MΩ·cm超纯水。

1.2螺旋铂金电极的制备

采用螺旋型铂金电极的传感器示意结构如图1所示。主要包括Pt-Ir线圈型工作电极、GOD、选择性半透膜等。

图1　螺旋电极示意图

1.2.1铂工作电极的制备

取长约4 cm~7 cm的医用级铂铱丝（Φ0.125 mm，Pt∶Ir=9∶1），剥离去除末端1 cm左右的Teflon涂层，在超纯水中超声处理5 mins。用无水乙醇擦拭的镊子将上述铂铱丝沿着皮下注射针头（30 gauge）紧密盘旋缠绕5圈~8圈，获得外径约为1 mm，内径约为0.85 mm的Pt-Ir线圈。将一小股纤维材料嵌入线圈内，用以提高GOD固定载量。

1.2.2GOD溶液的制备与涂覆

采用经典的化学交联的方法，以GA为交联剂，将GOD与BSA配制成氧化酶溶液，并在摇床上使其均匀混合。本实验采用两种不同GOD配比的酶配方，分别记作GOD-1/Epoxy-PU和GOD-2/Epoxy-PU电极。将前文所述的电极垂直悬挂在可移动胶带上，用10 μL的移液枪移取8 μL酶溶液滴涂到电极上面两次，其中滴涂前后间隔为30 mins，然后让修饰电极在室温环境下干燥1 h。

1.2.3Epoxy-PU［9-10］半透膜的制备与涂覆

将4 mL THF，26.7 mg的PU，1 mg Brij30及Epoxy按比例配置成Epoxy-PU溶液。将制备好的螺旋线圈型酶电极，垂直悬挂在可移动胶带上，使用10 μL的移液枪分别移取2 μL、4 μL和6 μL和Epoxy-PU溶液，滴涂到不同酶电极上。将修饰Epoxy-PU的酶电极放置在室温下干燥30 mins，然后放置在80℃恒温干燥箱中固化20 mins。制备完成的电极，置于0.15 mol/L的PBS缓冲溶液中，并在4℃环境下冷藏。

1.3实验测试

实验采用CHI660D电化学工作站（上海辰华）的三电极体系：其中自制的铂铱螺旋线圈电极为工作电极，Pt丝为对电极，饱和甘汞电极（SCE）为参比电极。在自制的聚四氟乙烯电化学反应池中，以PBS缓冲溶液作为支持电解质，加入适量葡萄糖溶液，用循环伏安法和计时电流法的电化学表征方法对所制备的电极进行测试。循环伏安测试是在静态溶液中进行，电位范围是0.2 V~ 0.8 V（vs. SCE），扫描速率为50 mV/s；计时电流测试的控制电位为0.7 V，同时在磁力搅拌的电解池中进行。选用S-4800型场发射扫描电镜（日立）观测半透膜的形貌，采用1.0 kV的操作电压、2 kV的加速电压和1 μA的电子束电流的Schottky辐射源。

2　结果与讨论

2.1PU含量的影响

本文考察不同Epoxy-PU半透膜厚度对传感器性能的影响，首先在螺旋电极（配方1）外层分别涂覆2、4和6 μL的Epoxy-PU溶液，然后将电极置于8 mL PBS底液中，工作电位为0.7 V，考察电极对2 mmol/L~30 mmol/L之间7个不同葡萄糖浓度的响应电流-时间曲线，如图2所示。

图2　GOD-1/Epoxy-PU电极对不同葡萄糖浓度的计时安培电流响应曲线

从图2可以看出，当滴涂2 μL Epoxy-PU时，在2 mmol/L~30 mmol/L之间的电极响应都呈现出标准的饱和曲线台阶，并在整个测量范围内实现良好的线性度。相比于滴涂4 μL Epoxy-PU的修饰电极，当溶液中葡萄糖浓度增加到20 mmol/L时，电流响应达到最高值后便开始逐渐下降。相比于滴涂6 μL Epoxy-PU、葡萄糖浓度达到15 mmol/L时，响应电流达到最高值后便出现骤降且下降幅度也较涂覆4 μL Epoxy-PU的电极大。在本研究中，PU作为一种多孔聚合物半透膜，它可以起到筛分作用，能限制外部溶液的葡萄糖分子进入传感器从而提高传感器的线性响应范围。但是，当其厚度达到一定值时（如4 μL Epoxy-PU），不仅会限制外部溶液的葡萄糖分子进入，还限制了葡萄糖分子通过半透膜进入传感器的传递速度。从而使得检测范围减小，以至于线性响应范围大幅下降。因此，涂覆2 μL Epoxy-PU溶液所得半透膜层性能最佳。

图3为GOD-1/Epoxy-PU电极在5 mmol/L葡萄糖溶液中不同扫速下的循环伏安曲线（a）以及电极的峰电流与扫速之间的线性关系图（b）。如图3（a）所示，随着扫速的增加，GOD-1/Epoxy-PU电极的氧化峰电流逐渐增加。通过对曲线的峰电流值进行拟合，所得方程如下：

Ipa=869.933+19.81v（1）

其中，I表示响应电流；v表示扫描速率。由图3（b）可知，氧化峰电流与扫描速率呈现出良好的线性关系，表明GOD-1/Epoxy-PU电极对葡萄糖的电催化氧化反应是一个典型的表面控制过程的电化学行为。

图3　不同扫速时循环伏安图和电极峰电流与扫速线性关系图

我们在原有Epoxy-PU溶液的配方基础上，改变PU的含量，通过计时安培响应曲线来比较PU含量对电极性能的影响，以确定最优配方。如图4所示，在螺旋电极外层涂覆2 μL Epoxy-PU溶液，考察溶液中不同PU含量对传感器性能的影响。以8 mL PBS为底液，工作电位设置为0.7 V，考察2 mmol/L~30 mmol/L之间7个不同葡萄糖浓度的响应-电流时间曲线。由图4可以看出，随着PU含量的增加，传感器对电流的响应也在逐渐减小。PU含量为30.7 mg时，虽然传感器的响应时间较之前PU含量为26.7 mg的更快（约为100 s），但是，我们可以发现：当滴加量达到15 mmol/L时，电流的响应值已开始显现出下降的趋势且线性拟合度也较之前PU含量为26.7 mg稍逊。当PU含量为44.1 mg时，传感器对于不同浓度的葡萄糖所响应的电流值，已不呈线性关系，所响应的电流值也较PU含量为26.7 mg时所响应的电流值下降了约7倍（按电流最大值计算）。当PU含量高达65.2 mg时，传感器对于不同浓度的葡萄糖几乎无响应的电流，这是由于PU浓度过大导致半透膜孔隙率急剧下降，葡萄糖分子透过几率很低。

图4　不同PU含量的计时安培电流响应

Epoxy-PU半透膜的显微结构对葡萄糖分子输运起到至关重要的作用，该膜层显微结构的SEM照片如图5所示，由图5可知，Epoxy-PU半透膜是一种多孔聚合物，呈现出一系列细小的孔洞，孔径大致为0.5 μm~1 μm。当用于传感器半透膜时，它可以起到筛分作用，将一些小分子（UA，AA等）过滤掉，从而提高传感器的线性范围。而随着PU含量的增加，孔隙率急剧降低，它不仅能阻挡一些小分子，还会阻碍葡萄糖分子的通过，这就再次验证前面所述，当PU含量为65.2 mg时，传感器对电流几乎无响应。由此可知，在Epoxy-PU半透膜中，PU最优配方为26.7 mg。

图5　Epoxy-PU半透膜的扫描电镜图

2.2改变酶配方对电流的影响

由图2可以看出：GOD-1/Epoxy-PU电极所获得的葡萄糖响应电流在25 mmol/L时高达3 μA，该电流是通过检测过氧化氢在固定电势下释放的电子而测得，可用如下反应式表达［11］：

由上式可知，溶液中葡萄糖被GOD催化氧化的酶促反应过程是需要氧气参与的，因此氧气在溶液中的含量对反应有重大影响。在人体皮肤下间质液中，氧的浓度大约是葡萄糖的浓度的三十分之一，所以电流一旦过大，而体内氧气供给不足，不利于反应的进行，导致响应信号的非线性。为此，我们设计出另外一组氧化酶配比，GOD-2，采用最佳PU含量为26.7 mg的半透膜Epoxy-PU溶液，构建出GOD-2/Epoxy-PU电极。

如图6是GOD-2/Epoxy-PU电极在8 mL PBS底液中，工作电位为0.7 V条件下，传感器外层分别涂覆2、4和6 μL Epoxy-PU对于不同浓度的葡萄糖所获得电流-时间响应阶梯曲线。由图6可知，在该传感器外层滴加的2 μL，4 μL和6 μL Epoxy-PU时，都成功实现了葡萄糖浓度再2 mmol/L~30 mmol/L生理区间的线性响应。值得关注的是，该电极获得的葡萄糖响应电流值降到1 μA以内，较GOD-1/Epoxy-PU电极大幅下降，这对于减少氧气含量的影响，提高电极响应电流的线性度有重要意义。此外，随着Epoxy-PU滴加量的加大，响应的时间也逐渐增长，滴加2 μL Epoxy-PU时，能在较短的时间内达到平衡，而滴加4和6 μL Epoxy-PU时，响应也随之减慢。

图6　GOD-2/Epoxy-PU电极对不同葡萄糖浓度的计时安培电流响应曲线

根据图6的计时安培电流检测阶梯曲线，得到GOD-2/Epoxy-PU电极在不同PU涂层下对葡萄糖浓度的响应电流，其值如表1所示，相应的电流响应线性拟合图如图7所示。从图表中可以看出，GOD-2/ Epoxy-PU电极在外层分别涂覆2、4和6 μL PU半透膜时，其电流响应的线性拟合相关系数R2分别为98.964%、99.784%、99.938%，表明这三种厚度的PU涂覆都可以获得良好的响应线性度。我们将传感器的灵敏度S（单位为nA/（mmol/L））设定为：

其中：I1和I2分别为15 mmol/L和5 mmol/L葡萄糖对应的响应电流值，C1和C2分别为15 mmol/L和5 mmol/L葡萄糖溶液浓度值。从图7和表1可以得出，GOD-2/Epoxy-PU电极涂覆2、4、6 μL PU半透膜后的灵敏度分别为20.27 nA/(mmol/L)、30.45 nA/(mmol/L)、15.07 nA/(mmol/L)。

表1　GOD-2/Epoxy-PU电极在不同PU涂层下对葡萄糖浓度的电流响应值

图7　GOD-2/Epoxy-PU电极在不同PU涂层下对葡萄糖浓度的电流响应线性拟合图

从图6可以看出，GOD-2/Epoxy-PU电极涂覆2 μL PU、4 μL PU、6 μL PU半透膜后达到稳态电流的时间分别是100 s、150 s、200 s。涂覆6 μL PU时，传感器的响应时间最长，灵敏度最低。涂覆4 μL PU时，传感器的响应时间约150 s，灵敏度最大。而涂覆2 μL PU时，传感器的响应时间最少（约100 s）。相比于涂覆4 μL PU和6 μL PU的电极，2 μL PU涂覆后的电极在2 mmol/L~30 mmol/L葡萄糖生理范围内，对7个不同葡萄糖浓度的响应电流时间曲线呈现出最为标准的饱和台阶。综合比较相关性能参数，GOD-2/Epoxy-PU涂覆2 μL PU的电极表现出最佳性能。

2.3传感器重复性，稳定性和抗干扰性

选用性能最优的涂覆2 μL PU的GOD-2/Epoxy-PU电极，先后测量了三次计时安培电流响应曲线，如图8所示。从中可以看出，三次测试都能获得良好的安培电流响应曲线，虽然每次测试时电流响应值有所增加，但对应于每个葡萄糖浓度梯度的电流变化甚小，对葡萄糖浓度达到15 mmol/L测量时其相对标准偏差为7.31%，表明基于该电极的传感器具有良好的重现性。

图8　GOD-2/Epoxy-PU电极对不同浓度葡萄糖的三次计时电流响应图

对所制备的GOD-2/Epoxy-PU电极进行稳定性测试，电极存放在4摄氏度冰箱内，1周后检测电流响应信号为初始信号的96.1%，6个月之后，响应电流仍可达到初始信号的80%以上。这表明GOD可以很好地固定在Pt-Ir合金螺旋线圈内的纤维材料上，H2O2对其产生的副作用较小，该传感器满足长期植入的需求。

Epoxy-PU作为传感器的高效选择性半透膜可以规避生物体内某些具有电化学活性干扰物，如：UA，AA。本传感器的工作电位为0.7 V，在此电位下，UA 和AA容易被电化学氧化［12］，产生干扰电流，从而影响结果。考虑到人体血糖内的葡萄糖浓度至少要30倍高于干扰物浓度，我们将抗干扰实验设置为分别注入5 mmol/L葡萄糖（glucose，Glu），0.5 mmol/L UA以及0.5 mmol/L AA。如图9所示，正常生理浓度范围内的UA（0.5 mmol/L）和AA（0.5 mmol/L），与5 mmol/L的葡萄糖相比仅仅产生可以忽略不计的电流响应，表明GOD-2/Epoxy-PU型螺旋电极对葡萄糖的检测具有良好的选择性。

图9　GOD-2/Epoxy-PU电极的抗干扰性测试

3　结论

本文通过考察PU涂覆厚度、PU含量以及不同酶配方来评估传感器的性能。首先通过比较两种不同PU含量Epoxy-PU溶液以及膜层滴涂厚度得到的计时电流响应阶梯曲线，研究表明，随着PU含量的加大，传感器的响应电流值逐渐减小至几乎无响应。当滴涂厚度为2 μL，PU含量为26.7 mg时，GOD-1/Epoxy-PU型传感器表现良好的性能。

为了减少溶液中氧含量缺乏的问题，通过比较两种不同配比的酶配方，发现GOD-2/Epoxy-PU电极相比于GOD-1/Epoxy-PU电极，响应电流值降到1 μA以内，灵敏度下降到20 nA/(mmol/L）~30 nA/ (mmol/L)之间。此外，GOD-2/Epoxy-PU电极重复性好，长期稳定性佳（6个月后电流响应信号可达初始信号的80%），表明所制备的葡萄糖传感器是满足长期植入需求的一款器件。抗干扰性物质（UA和AA）实验表明：GOD-2/Epoxy-PU型螺旋电极对葡萄糖的检测具有良好的选择性。此外，在选择性半透膜表面涂覆生物相容性水凝胶来进一步减小传感器植入后的产生纤维包膜的工作正在进行中。

参考文献：

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余江渊（1990-），男，硕士研究生，主要从事植入式葡萄糖传感器的研究，yjy19900422@126.com；

陈云霞（1976-），女，副教授，博士，国家日用及建筑陶瓷工程技术研究中心副主任、江西省“井岗之星”，主要研究方向为纳米光电材料和传统陶瓷材料。主持国家青年基金项目、江西省科技支撑计划和自然科学基金项目，yx_clouds@126.com。

朱志刚（1977-），男，教授，博士，环境与材料工程学院材料工程系主任、校金桥特聘教授、上海市高校特聘教授“东方学者”，主要研究方向为智能传感材料与器件。主持国家自然科学基金面上项目、上海科委基础研究重点项目、上海人才发展基金、教育部留学归国人员启动基金等项目，zgzhu@sspu.edu.cn；

Analysis on Electrostatically Actuated Diaphragm Micropumpwith Energy Equilibrium Method*

HU Yuanlin，LIANG Xin，WANG Wen*，ZHANG Yu
（Institute of Refrigeration and Cryogenics，School of Mechanical Engineering，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai 200240，China）

Abstract：The electrostatically actuated flexible diagram pump is analyzed in this paper，it is modeled with the mod⁃ified energy equilibrium method considering the kinetic energy of the diagram. Energy variation of the pump is also analyzed here. Compared with the results from the minimum energy method，the calculated pressure rise is 87.08 kPa with actuated voltage 300 V，and the pull-in radius of the diagram on the compression chamber is 4.06 mm，the pressure rise is a few higher than the result with the minimum energy method due to the impact of the kinetic energy of the diagram. With the proposed method，some factors，such as diaphragm thickness，dielectric layer thickness and cavity geometric parameters are discussed on the performance of the flexible diagram pump with double-cavity. Moreover，reducing the diagram thickness and its dielectric layer，decreasing the cavity depth and radius is helpful to improve the pressure rise of the micropump.

Key words：electrostatically actuated micropump；energy equilibrium method；large deformation of round diaphragm

doi：EEACC：8300；834010.3969/j.issn.1004-1699.2016.01.003

收稿日期：2015-04-17修改日期：2015-06-12

中图分类号：TQ174

文献标识码：A

文章编号：1004-1699(2016)01-0009-06

项目来源：上海高校特聘教授（东方学者）计划项目；国家自然科学基金项目（61471233）；上海市科委基础研究重点项目（13NM1401300）；上海市曙光计划项目（14SG52）；上海市人才基金项目（201346）；上海市科委扬帆计划项目（14YF1410600）；上海市教委晨光计划（13CG62）