基于“病证-效应-生物样本分析”方法的桑寄生补肝肾强筋骨功效物质及归经研究＊

赵华伟，汪 晶，崔 瑛＊＊，王桁杰，王君明，马 开

（1. 河南中医学院 药学院 郑州 450046；2. 呼吸疾病诊疗与新药研发河南省协同创新中心郑州 450046；3. 河南省中医药研究院 郑州 450000）

基于“病证-效应-生物样本分析”方法的桑寄生补肝肾强筋骨功效物质及归经研究＊

赵华伟1，2，汪 晶1，2，崔 瑛1，2＊＊，王桁杰1，2，王君明1，2，马 开3

（1. 河南中医学院 药学院 郑州 450046；2. 呼吸疾病诊疗与新药研发河南省协同创新中心郑州 450046；3. 河南省中医药研究院 郑州 450000）

目的：建立与桑寄生功效相对应的骨质疏松模型，观察桑寄生补肝肾强筋骨功效物质及其在大鼠体内分布与归经的关系。方法：采用维甲酸制造骨质疏松模型大鼠模型，观察桑寄生水煎液药效。同时以萹蓄苷、槲皮苷、芦丁为指标成分，对含药组织进行分析检测，观察其体内分布及代谢时间，研究功效相关物质的组织分布与归经的关系。结果：桑寄生水煎液能明显提高骨质疏松模型大鼠左股骨骨重、骨重/骨长、骨重/骨直径等指标，且能降低大鼠血清中骨钙素（OT）、碱性磷酸酶（ALP）含量。大鼠体内桑寄生指标成分的分析结果显示，芦丁仅在胃中有少量分布，萹蓄苷在组织中AUC0-t大小顺序为胃＞肾＞脑＞小肠＞大肠＞肝＞肺，体内维持时间长短顺序为肾=胃＞脑＞大肠＞小肠=脾＞肝＞心＞肺＞血清。槲皮苷在组织中AUC0-t大小顺序为肾＞胃＞肝＞心＞肺＞脾＞小肠＞大肠＞脑，体内维持时间长短顺序为肾=胃=脑=肺=肝=脾=心＞大肠＞血清＞小肠。结论：桑寄生水煎液可对抗维甲酸致大鼠骨质疏松，具有补肝肾、强筋骨作用；萹蓄苷、槲皮苷为桑寄生补肝肾、强筋骨代表成分；萹蓄苷、槲皮苷在大鼠体内分布与桑寄生归肾经的传统认识一致。

桑寄生 大鼠骨质疏松 药效 功效物质 归经

桑寄生为桑寄生科植物桑寄生Taxillus chinensis（DC.） Danser的干燥带叶茎枝，性平，味苦、甘，具有祛风湿、补肝肾、强筋骨、安胎的功效，临床常用于痹症日久、伤及肝肾、腰膝酸软、筋骨无力等病症[1]。目前，关于桑寄生的研究主要集中在化学成分、药理作用等方面。关于桑寄生功效物质和归经的研究尚未见报道。因此，本研究进行了桑寄生功效补肝肾、强筋骨功效物质及归经研究。

功效物质是指表达中药传统功效的化学物质。对中药功效的认识，是以一定的证候为基础，而化学物质的认识，又需要借助现代化学分析手段，故中药功效物质的认识既需要以证候和药效为基础，又需要借助化学分析手段。基于以上认识，本研究建立了“病症—效应—生物样本分析”结合研究中药功效物质的系统方法[2，3]。归经是药物对机体脏腑经络选择性的作用，有研究表明药物的作用部位与归经关系密切，且药物中功效成分在体内的分布是药物归经的重要依据[4，5]。因此，结合药代动力学方法，观察功效物质在病症模型动物中的分布，从而可以获得中药归经与药物分布相关性的认识[2，6，7]。

本研究是在上述思路的指导下，观察桑寄生对骨质疏松模型大鼠的作用，以反映桑寄生补肝肾、强筋骨功效。在此基础上，针对给药模型大鼠，开展生物样本（血清、脏腑组织）的化学成分分析，从而获得对桑寄生补肝肾、强筋骨功效物质的认识，通过桑寄生指标成分在脏腑组织的分布，探讨桑寄生的归经。

1 材料

1.1 实验药物

本研究中的桑寄生样品购于河南张仲景大药房（生产日期为2014年5月18日）。经河南中医学院陈随清教授鉴定为桑寄生科植物桑寄生Taxillus chinensis （DC.） Danser的干燥带叶茎枝。

龙牡壮骨颗粒（武汉健民药业集团股份有限公司，批号：1407223）；维甲酸（大连美仑生物技术有限公司）；萹蓄苷、槲皮苷（四川省维克其生物科技有限公司，批号分别为：130625、130508）；槲皮素（中国食品药品检定研究院，批号：100080-200306）。

1.2 试剂

骨钙素（OT） ELISA检测试剂盒、碱性磷酸酶（ALP）ELISA检测试剂盒（武汉基因美生物科技有限公司，批号分别为：201501、201501）。甲醇、乙腈、磷酸均为色谱纯。

1.3 实验仪器

TGL-16gR高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；不锈钢数显卡尺（上海尺喜工量具有限公司）；酶标仪（美国BioTek Instruments公司），Waters e2695高效液相色谱仪自带Waters2489检测器（美国Waters公司）； AE240电子分析天平（瑞士梅特勒仪器有限公司）；氮气吹干仪（北京八方世纪）。

1.4 实验动物

SPF级Wistar大鼠，雄性，体质量160±10 g，购于山东鲁抗医药股份有限公司质检中心实验动物室，批号：0017218，许可证号：SCXK（鲁）20130001；分笼饲养在20±2 ℃的动物室，专人饲养和管理，饲以标准全价饲料。

2 方法

2.1 药物制备

2.1.1 桑寄生水煎液的制备

取桑寄生药材粉碎成粗粉，加10倍量（重量）水浸泡30 min，煎30 min，滤过，药渣加8倍量（重量）水煎煮20 min，滤过，合并两次滤液，低温浓缩至1 g·mL-1的桑寄生水煎液。

2.1.2 龙牡壮骨颗粒混悬液的制备

取龙牡壮骨颗粒255 g，加蒸馏水超声溶解，配制成0.5 g·mL-1的混悬液。

2.2 造模与给药

大鼠不限食水饲养5天，禁食24 h后称重，标记，随机分为正常组、模型组、阳性组（龙牡壮骨颗粒组）、桑寄生高、中、低剂量组，每组9只（其中桑寄生高剂量组18只）。除空白组外各组大鼠上午用1%羧甲基纤维素钠配成的维甲酸混悬液70 mg·kg-1灌胃[8，9]；下午各组大鼠给予相应的药物或生理盐水，其中桑寄生各剂量组分别给予桑寄生高（10 g·kg-1）、中（5 g·kg-1）、低（2.5 g·kg-1）剂量水煎液，阳性组给予龙牡壮骨颗粒混悬液（5 g·kg-1）[10-12]，每日灌胃1次，空白、模型给予生理盐水。灌胃体积1 mL/100g，连续给药14天后，停止给予维甲酸，每日下午各组大鼠继续给予相应药物或生理盐水14天。

2.3 取材

各组大鼠于给药28天当晚禁食不禁水。次日桑寄生高剂量组9只大鼠分别于给予桑寄生高剂量水煎液后10、30、40、60、80、90、120、240、360min时摘眼球取血，脱颈椎处死，立即取心、肝、脾、肺、肾、胃、脑、大肠、小肠，用于测定各成分的组织分布，其余大鼠分别于给药30 min后摘眼球取血，脱颈椎处死。所有全血均静置0.5 h后置低温高速离心机中10 000 r·min-1离心10 min，取上清液-20℃冰箱保存备用。

2.4 血清样品的处理

全血10 000 r·min-1离心10 min后，精密吸取1.5 mL血清置10 mL离心管中，加入3倍量甲醇（按血清：甲醇=1:3的比例），用快速混匀器充分振摇5 min，10 000 r·min-1离心10 min，吸取上清液置另一个10 mL离心管中，沉淀物再次精密加入3倍量甲醇，用快速混匀器充分振摇5 min，10 000 r·min-1离心10 min，合并两次上清液。50℃氮气吹干，精密加入甲醇2 mL，超声提取5 min，取上清液用0.22 μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。血清用于血清中骨钙素（Osteocalcin，OT）浓度、碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，ALP）浓度的检测，按照试剂盒说明书用ELISA（酶联免疫法）检测。血清也用于桑寄生的化学成分分析。

2.5 组织样品的处理

将各组织用生理盐水洗净，滤纸吸干，精密称取约1 g的组织（不足1 g的称取全部），剪碎，加入3倍量生理盐水（按组织：生理盐水=1 g：3 mL的比例），置10 mL离心管中，用细胞破碎仪破碎。组织破碎液精密加入3倍量甲醇（按组织1 g：甲醇3 mL的比例），快速混匀器充分振摇5 min，10 000 r·min-1离心10 min，吸取上清液置另一个10 mL离心管中，沉淀物再次精密加入3倍量甲醇，用快速混匀器充分振摇5 min，10 000 r·min-1离心10 min，合并两次上清液。50℃氮气吹干，精密加入甲醇2 mL，超声提取5 min，取上清液用0.22 μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。用于桑寄生化学成分分析。

2.5 HPLC含量测定方法

2.5.1 色谱条件

Platisil ODS C18色谱柱（5μm，250×4.6 mm），流动相乙腈（A）-0.1% 磷酸水（B）；流速：0.8 mL·min-1；柱温：28℃；进样量10 μL；检测波长：330 nm；洗脱梯度：79%B（2 min）→79%B（15 min）→77%B（20 min）→77%B（30 min）→79%B（35 min）。

2.5.2 对照品溶液的制备

精密称取对照品萹蓄苷1.00 mg、槲皮苷1.00 mg和芦丁1.00 mg，分别于3个10 mL容量瓶中，用甲醇溶解、定容，配制成萹蓄苷、槲皮苷和芦丁浓度为0.100 mg·mL-1的单一对照品储备液。

分别精密量取单一对照品溶液适量于同一容量瓶中，用甲醇稀释成浓度分别为含0.005、0.02、0.08、0.15、0.2、0.25、0.5、0.75、1 μg·mL-1萹蓄苷的对照品溶液， 0.005、0.02、0.08、0.15、0.25、0.5、1、2、2.5 μg·mL-1槲皮苷的对照品溶液，含0.005、0.02、0.05、 0.08、0.15、0.2、0.25、0.5、0.75 μg·mL-1芦丁的对照品溶液，4℃冷藏避光贮藏备用。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 大鼠一般情况观察

实验过程中各组大鼠体重均有所增加，模型组大鼠体重增加幅度不及其它组，除空白组外其余各组在给予维甲酸一周左右相继出现竖毛、拱背，活动量减少，其中模型组最为明显。停止给予维甲酸后，阳性组和桑寄生高、中、低剂量组大鼠的竖毛、拱背状况得到极大改善。

3.2 对骨质疏松模型大鼠左股骨骨重、骨长、骨直径的影响

模型组较空白组左股骨骨重、骨长、骨重/骨直径、骨重/骨长均有显著降低，阳性组、桑寄生水煎液高剂量组与模型组比较，骨重、骨重/骨直径、骨重/骨长均有明显改善；桑寄生水煎液中剂量、低剂量与模型组相比，骨重、骨重/骨直径、骨重/骨长差别不显著。结果表明，一定剂量桑寄生水煎液能增加大鼠左股骨骨密度，见表1、2。

表1 对骨质疏松模型大鼠左股骨骨重、骨长、骨直径的影响（±s，n=9）

表1 对骨质疏松模型大鼠左股骨骨重、骨长、骨直径的影响（±s，n=9）

注：与正常组比较，##P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01。

组别骨重/g骨长/mm骨直径/mm正常组0.816 3±0.419 3 30.664 4±1.359 0 6.573 3±0.584 4模型组0.530 4±0.079 4##27.524 4±1.670 4##6.368 9±0.569 5阳性组0.707 8±0.064 2**27.380 0±2.025 86.241 1±0.429 7桑寄生高剂量0.684 7±0.100 3**27.764 4±1.135 26.162 2±0.302 8桑寄生中剂量0.589 4±0.041 928.565 6±0.915 26.616 7±0.462 1桑寄生低剂量0.542 3±0.059 827.152 2±1.594 36.383 3±0.3692 2

表2 对骨质疏松模型大鼠左股骨骨重/骨长、骨重/骨直径的影响（±s，n=9）

表2 对骨质疏松模型大鼠左股骨骨重/骨长、骨重/骨直径的影响（±s，n=9）

注：与正常组比较，##P＜0.01；与模型组比较**P＜0.01。

组别骨重/骨直径（g∙mm-1）骨重/骨长（g∙mm-1）正常组0.125 0±0.012 3 0.026 6±0.001 4模型组0.083 7±0.012 9##0.019 2±0.001 9##阳性组0.113 8±0.011 4**0.026 1±0.003 9**桑寄生高剂量0.110 9±0.013 3**0.024 8±0.004 2**桑寄生中剂量0.089 5±0.010 1 0.020 6±0.001 5桑寄生低剂量0.085 4±0.014 5 0.020 1±0.003 4

3.3 血清中骨钙素、碱性磷酸酶浓度的检测结果

模型组与正常组比较，血清中骨钙素（OT）、碱性磷酸酶（ALP）浓度明显提高，阳性组及桑寄生给药组能明显降低血清中OT、ALP浓度水平，其中阳性组及桑寄生给药组中OT 、ALP 浓度水平与模型组比较，差异具有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）。见表3。

3.4 组织样品桑寄生指标成分药代动力学参数分析

各组织桑寄生成分浓度-时间经DAS 2.0统计处理后发现，萹蓄苷在组织中AUC0-t大小排序为胃＞肾＞脑＞小肠＞大肠＞肝＞肺，Cmax大小排序为胃＞肾＞小肠＞脑＞肝＞大肠＞肺，Tmax大小排序为大肠＞小肠=胃＞肾=肝＞肺=脑；槲皮苷组织中AUC0-t大小排序为肾＞胃＞肝＞心＞肺＞脾＞小肠＞大肠＞脑，Cmax大小排序为胃＞肝＞肾＞心＞脾＞小肠＞肺＞脑＞大肠，Tmax大小排序为大肠＞肺＞肝=心=胃＞小肠＞脑＞脾=肾，见表4、5、6。

表3 对大鼠血清OT、ALP 测定值的影响（¯x±s，n=9）

表4 维甲酸骨质疏松模型桑寄生水煎液高剂量组织萹蓄苷含量药代动力学参数

表5 维甲酸骨质疏松模型桑寄生水煎液高剂量组织槲皮苷含量药代动力学参数

表6 桑寄生指标成分在大鼠体内组织分布与归经相关性

4 讨论

4.1 桑寄生补肝肾、强筋骨药效观察

本实验中，模型组大鼠拱背、竖毛、体重增加迟缓、活动减少、反应迟钝，并且该组大鼠左股骨重、骨重/股直径、骨重/骨长等指标明显下降，从侧面反映出维甲酸可致大鼠左股骨骨密度降低，表明造模成功[13]。阳性组和桑寄生水煎液高、中剂量组均能提高大鼠左股骨重、骨重/股直径、骨重/骨长，与模型组比较，差异显著（P＜0.01），表明桑寄生具有对抗维甲酸大鼠骨质疏松作用。维甲酸可降低正常人成骨细胞的活性，并抑制成骨细胞增殖、激活破骨细胞，使血清中ALP、OT等指标明显升高[14]。阳性组、桑寄生各剂量组均能降低血清中OT 、ALP水平，与模型组比较，差异显著（P＜0.01，P＜0.05），表明桑寄生水煎液可抑制骨吸收，提高骨质量，改善骨代谢的负平衡状态，从而达到治疗骨质疏松的作用。上述结果表明，桑寄生水煎液可对抗维甲酸所致大鼠骨质疏松，具有补肝肾、强筋骨作用。

4.2 桑寄生功效物质观察及其分布与归经的关系

桑寄生主要含黄酮类、生物碱、萜类、有机酸、多糖、蛋白质、凝集素等化学成分[15]。桑寄生中所含黄酮类成分主要为槲皮素、萹蓄苷、槲皮苷、芦丁、广寄生苷等[16，17]。体外研究表明，黄酮类物质可通过抑制破骨细胞分化，促进骨形成，起到抗骨质疏松的作用[18]。根据上述研究成果，本实验选择萹蓄苷、槲皮苷、芦丁等黄酮类成分作为桑寄生的指标成分。维甲酸致骨质疏松模型大鼠的组织分布结果显示，槲皮苷分布于脑、心、肝、脾、肺、肾、胃、大肠、小肠、血清中，萹蓄苷分布于肺、肾、胃、小肠，芦丁仅在胃中有少量分布。结合药理实验结果可知，萹蓄苷、槲皮苷是桑寄生补肝肾、强筋骨的代表性成分。指标成分在组织中的药代动力学参数AUC0-t、维持时间结果分析表明，萹蓄苷在维甲酸致骨质疏松模型大鼠肾组织中AUC0-t较大（居于第2位），肾内药物维持时间上居首位，提示萹蓄苷在肾组织中分布较多，维持较长，与桑寄生归肾经的传统认识一致。萹蓄苷在肺中分布较多，提示桑寄生还可能作用于肺经，但仍需要进一步实验证明。槲皮苷在维甲酸致骨质疏松模型大鼠肾组织中AUC0-t和药物维持时间均居首位，提示槲皮苷在肾组织中作用更强，这与桑寄生归肾经的传统认识的认识一致。因此，桑寄生归肾经的主要功效物质为槲皮苷、萹蓄苷。

综上所述，桑寄生对抗维甲酸所致大鼠骨质疏松的功效相关成分为萹蓄苷、槲皮苷。因此，萹蓄苷、槲皮苷为桑寄生补肝肾、强筋骨功效的代表性成分。萹蓄苷、槲皮苷在维甲酸致骨质疏松模型大鼠体内分布情况与桑寄生归肾经具有高度一致性，符合桑寄生归肾经的传统认识。

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A Research of Effective Chemicals of Taxillus Chinensis Danser on Osteoporosis and Channel Tropism Based on Disease-Effect-Bioanalysis

Zhao Huawei1,2, Wang Jing1,2, Cui Ying1,2, Wang Hengjie1,2, Wang Junming1,2, Ma Kai3
(1. School of Pharmacy, Henan College of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China;
2.Collaborative Innovation Center for Respiratory Disease Diagnosis And Treatment & Chinese Medicine Development of Henan Province, Zhengzhou 450046 ,China;
3. Henan Academy of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, China)

This study aimed to observe the effect of Taxillus on osteoporotic rats and investigate effective chemicals of Taxillus, in order to find out the relationships between their body distribution and the channel tropism of Taxillus. The osteoporotic rat models were established through retinoic acid administration to observe the efficacy of the water solution of Taxillus. Besides, taking rutin, avicularin and quercetin as indexes, organs of all rats were prepared to measure their distributions and metabolism before analyzing the correlation between body distribution of effective chemicals and channel tropism of Taxillus. It was found that Taxillus solution significantly improved weight (W), W / length (L) and W / diameter (D) of osteoporotic rats, and reduced the contents of osteocalcin (OT) and alkaline phosphatase (ALP). Rutin, one of the indexes in this study, was seldom in the stomach. AUC0-t of avicularin showed its distribution in stomach, kidney, brain, small intestine, large intestine, liver, lung from most to least in content. The metabolism results showed that avicularin stayed longer time in stomach and kidney than that in brain, large intestine, small intestine and spleen, liver, heart, lung, and plasma. And AUC0-t of quercetin showed its distribution in kidney, stomach, liver, heart, lung, spleen, small intestine, large intestine and brain from most to least in content. Quercetin kept longer time in kidney, stomach, liver, heart, spleen and brain than that in large intestine, plasma and small intestine. In conclusion, water solution of Taxillus was effective in the treatment of osteoporotic rats. Avicularin and quercetin, as the main substance of Taxillus, functioned in nourishing liver and kidney. Their distributions in rats were consistent with the channel tropism of Taxillus.

Taxillus, osteoporotic in rats, pesticide effect, effective chemicals, channel tropism

10.11842/wst.2016.04.012

R285.1

A

（责任编辑：马雅静，责任译审：朱黎婷）

2015-10-08

修回日期：2015-11-17

＊ 国家自然科学基金委面上项目（81473368）：基于“病证-效应-生物样本分析”方法的生姜、干姜、炮姜药性物质研究，负责人：崔瑛。

＊＊ 通讯作者：崔瑛，教授，博士生导师，主要研究方向：中药药性物质研究。