柴胡醇提物抗肝纤维化药效及伴随毒副作用研究＊

孙晓倩，黄娜娜，窦立雯，李晓宇，孙 蓉＊＊

（1. 山东省中医药研究院 济南 250014；2. 山东中医药大学药学院 济南 250355）

柴胡醇提物抗肝纤维化药效及伴随毒副作用研究＊

孙晓倩1，2，黄娜娜2，窦立雯2，李晓宇1，孙 蓉1＊＊

（1. 山东省中医药研究院 济南 250014；2. 山东中医药大学药学院 济南 250355）

目的：研究柴胡醇提物对肝纤维化大鼠模型的保护作用及伴随毒副作用，为柴胡“功效—毒性”相关性研究提供实验数据。方法：通过给予高脂、酒精刺激和猪血清等造成大鼠肝纤维化模型，同时给予不同剂量的柴胡醇提物和阳性药，观察其在发挥药效作用时的伴随毒副作用，同时观察大鼠一般情况、体质量、日摄食量、日饮水量、证候积分，检测大鼠血中ALT、AST、HA、LN、IV-C、PCIII、TGF-β1、BUN、Cr指标的含量，计算主要脏器系数并进行病理组织学检查。结果：连续给予0.90-3.60 g·kg-1的柴胡醇提物可改善大鼠饮食、饮水和活动情况，明显降低肝纤维化大鼠血中HA、LN、IV-C、PCIII等指标含量和肝脏系数，病理组织学改变减轻。但血ALT、AST水平出现柴胡高剂量反跳升高、血BUN、Cr水平增高。结论：柴胡醇提物可以明显改善大鼠肝纤维化程度，且量效关系良好，同时3.60 g·kg-1的柴胡醇提物会产生一定的肝脏、肾脏的伴随毒副作用，尤其肝脏为重。

柴胡 醇提物 肝纤维化 大鼠 毒副作用

柴胡为伞形科植物柴胡 Bupleurum chinense DC.或狭叶柴胡 Bupleurum scorzonerifolium Willd.的干燥根，具有解表退热、疏肝解郁、升举清气的功效，临床常用于治疗寒热往来、感冒发热、肝郁气滞、月经不调、胸胁疼、气虚下陷、久泻脱肛等症[1]。柴胡化学成分种类复杂，主要包括皂苷类、挥发油类、黄酮类、多糖类等[2]，各类成分均具有广泛的药理作用。现代研究表明，柴胡及其有效成分柴胡皂苷有解热、镇静、抗炎、抗脂肪肝、抗肝损伤、利胆、降转氨酶、兴奋肠平滑肌、抑制胃酸分泌、抗溃疡、抑制胰蛋白酶等作用[3,4]。临床上常使用含柴胡的汤剂如小柴胡汤、柴胡疏肝散等[5,6]治疗肝纤维化，效果显著。柴胡虽被《神农本草经》列为上品，但在历年使用过程中亦出现一定的毒副作用，叶天士提出“柴胡劫肝阴”，引起学者重视。近年来，临床上出现使用柴胡导致患者出现血胆红素、氨基转移酶异常、头晕目眩等不良反应的报道。

本实验室前期研究[7,8]发现，北柴胡醇提组分小鼠急性毒性MTD为75.2 g·kg-1，长期、大量给予柴胡醇水提物可导致大鼠肝毒性损伤，主要表现为血丙氨酸氨基转移酶（Alanine Aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（Aspartate Aminotransferase，AST）增高，血中和肝组织内丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量增加，同时超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）、谷胱甘肽（L-Glutathione，GSH）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathion Peroxidase，GSH-Px）活性下降；血中总巯基（-SH）含量下降。柴胡中皂苷d成分具有较好的抗肝纤维化的药效[9]。但是，在长期用药中亦出现肝毒性损伤，其损伤途径可能与氧化应激损伤有关[8]，目前尚未有柴胡关于发挥药效与毒性的剂量范围研究与报道。故本研究采用实验室前期建立的高脂、酒精、猪血清等复合因素建立适合中药药效评价的肝纤维化动物模型[10]，进行柴胡醇提取物抗肝纤维化药效及伴随毒副作用研究，进一步阐明柴胡醇提物的抗纤维化药效伴随毒副作用的发生剂量、作用机制，明确其伴随毒副作用与抗肝纤维化药效的关系，以期为柴胡的临床合理用药提供数据。

1 实验材料

1.1 主要仪器与试剂

PL303精密电子天平（梅特勒·托利多有限公司），YP20001电子天平（上海上天精密仪器有限公司），UV2600 紫外分光光度计（上海尤尼柯仪器有限公司），Multiskan Go-1510全波长酶标仪（中国赛默飞世尔科技有限公司），PL303电子天平（瑞士梅特勒托利多有限公司），HH-S 恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器厂），TDZ5- WS 台式低速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）。ALT、AST、尿素氮（Blood Urea Nitrogen，BUN）、肌酐（Creatinine，Cr）（南京建成生物科技有限公司，批号：20150103、20150103、20150215、20150321），透明质酸（Hyaluronic Acid，HA）、层粘连蛋白（Laminin，LN）、III型前胶原（Precollagen，PCIII）、IV型胶原（IV-C）、转化生长因子（Transforming Growth Factor，TGF-β1）ELISE试剂盒（南京建成生物科技有限公司，批号：201412、201412、201412、201412、201412）。标准猪血清（上海亿欣生物科技有限公司，批号：20121214），食用酒精为市售红星二锅头（52°），临用时用蒸馏水稀释成所需浓度，胆固醇（上海源聚生物科技有限公司）。

1.2 试药与药材

阳性对照药物秋水仙碱片（云南植物药业有限公司，批号：20130901）在用前配制成0.018 g·L-1水溶液。阳性中药对照复方鳖甲软肝片（内蒙古福瑞医疗科技股份有限公司，批号：20131209）在用前配制成0.108 g·L-1水溶液。

柴胡药材购自河北省安国药材批发市场，经山东省中医药研究院林慧彬研究员进行品种鉴定为伞形科植物北柴胡Bupleurum chinense DC.的干燥根，批号：20140923，已根据2010版《中国药典》柴胡项下要求进行检查，符合各项规定。

柴胡醇提物的制备：精确称取900 g柴胡，加入10倍量60%乙醇提取2次，每次1.5 h，滤过，合并滤液，回收乙醇至无乙醇味，浓缩至200 mL，即得。含生药量4.5 g·mL-1，临用时用蒸馏水稀释成所需浓度的混悬液。其中柴胡皂苷a在生药量中的含量为0.087%，柴胡皂苷d在生药量中的含量为0.046%，含量测定方法[11]参照2010版《中国药典》。

1.3 实验动物

SPF级Wistar大鼠70只，雄性，体质量（260-320 g），适龄、健康，共70只。购于山东大学实验动物中心。动物合格证编号：SCXK（鲁）20130001。实验动物配合饲料（鼠），生产许可证号：SCXK（鲁）20130014。

2 方法

2.1 分组与给药

根据大鼠体质量，将70只实验动物随机分为7组，每组10只，即正常对照组、模型对照组、柴胡醇提物高、中、低剂量组和阳性药（秋水仙碱片组、复方鳖甲软肝片）组。6组造模组实验动物在造模第一天开始分组给药，正常对照组灌胃蒸馏水，各组均按10 mL·kg-1给药，连续给药21天。

2.2 模型制备

根据文献研究[12]，对肝纤维化造模方法进行适当改善，对6组造模组实验动物采用复合因素造成大鼠肝纤维化模型，连续造模3周。造模方法如下：①大鼠腹腔注射经过滤、灭菌处理的新鲜猪血清0.5 mL，每周2次。②以89.5%单纯玉米粉加10%猪油、0.5%胆固醇制成高脂低蛋白饲料饲养。③第1周每天10%乙醇灌胃，第2-3周以5%乙醇灌胃。

2.3 样本采集与检测

实验期间，分别于药后第0、1、6、11、16、21天观察大鼠一般情况，并进行体质量、日食量、日水量的测定。第21天药后2 h，对各组大鼠眼眶取血，3 500 rpm离心10 min，离心温度为25℃，取上清，检测血清中ALT、AST、BUN、Cr、LN、HA、PCIII、IV-C、TGF-β1等指标的水平。处死大鼠，取肝、脾、胸腺，称重，计算脏器系数，公式如下。

取大鼠相同部位肝组织固定于10%中性福尔马林液内，做肝组织马松染色，光学显微镜下观察肝组织形态学变化。对肝组织形态进行病理分级、积分：肝组织正常，无胶原纤维增生（I），0分；胶原纤维从汇管区或中央静脉周围轻度向外延伸（II），1分；胶原纤维延伸明显（III），2分；胶原纤维包绕/分割肝小叶以至正常肝小叶结构破坏（IV），3分；肝小叶结构完全破坏，肝内布满小圆形假小叶，假小叶内有粗大增生的胶原纤维（V），4分。

2.4 数据统计分析

采用SPSS 11.5统计软件进行分析，计量资料数据均以均数±标准差（±s）表示，组间均数比较采用单因素方差分析检验，P＜0.05为数据统计有显著性差异，P＜0.001为数据统计有非常显著性差异，P＜0.05为数据统计有极显著性差异。

3 实验结果

3.1 柴胡醇提物对大鼠一般情况的影响

实验过程中，正常对照组大鼠的精神状态良好，活动迅速，眼睛有神，饮食粪便正常，皮毛光泽、柔顺，体质量逐渐增加，无异常状态出现。模型对照组大鼠精神状态不佳，精神倦怠，自发活动减少，身体软弱无力，眼睛无光彩，被毛蓬乱发黄，腹部膨胀，粪便稀溏，部分不成形，饮食饮水减少，体质量增长缓慢。柴胡醇提高、中、低剂量组能明显改善大鼠症状，且具有一定的剂量依赖关系，但是在连续给予柴胡醇提高剂量组16天后，大鼠会出现怠动，体质量增长缓慢、饮食饮水降低等症状。

3.2 柴胡醇提物对大鼠体质量的影响

如表1所示，与正常对照组比较，给药11天后，模型对照组大鼠体质量显著降低（P＜0.05），给药16天后，模型对照组大鼠体质量显著降低（P＜0.01），柴胡醇提中、低剂量组大鼠体质量显著降低（P＜0.05），给药21天后，模型对照组大鼠体质量显著降低（P＜0.001），柴胡醇提高、中剂量组、复方鳖甲软肝片组、秋水仙碱组大鼠体质量降低（P＜0.05），柴胡醇提低剂量组大鼠体质量显著降低（P＜0.01）；与模型对照组比较，给药16天后，柴胡醇提高、中剂量组、复方鳖甲软肝片组、秋水仙碱组大鼠体质量升高（P＜0.05），给药21天后，柴胡醇提高、中剂量组、复方鳖甲软肝片组、秋水仙碱组大鼠体质量显著升高（P＜0.01），柴胡醇提低剂量组大鼠体质量升高（P＜0.05）。说明采用复合因素造模方法会使大鼠的体质量增长缓慢，灌胃给予不同剂量的柴胡醇提物可以改善大鼠体质量增长情况，并呈现一定的剂量关系。

3.3 柴胡醇提物对大鼠日食量、日水量的影响

如表2所示，与正常对照组比较，给药11天、16天后，模型对照组大鼠的日食量显著降低（P＜0.01），柴胡醇提低剂量组大鼠的日食量显著降低（P＜0.05），给药21天后，模型对照组大鼠的日食量显著降低（P＜0.001），柴胡醇提高、中剂量组、复方鳖甲软肝片组和秋水仙碱组大鼠的日食量显著降低（P＜0.05），柴胡醇提低剂量组大鼠的日食量显著降低（P＜0.01）；与模型对照组比较，给药16天后，柴胡醇提高剂量、复方鳖甲软肝片组、秋水仙碱组大鼠的日食量增加（P＜0.05），给药21天后，柴胡醇提高、中剂量组和复方鳖甲软肝片组、秋水仙碱组大鼠的日食量增加（P＜0.01），柴胡醇提低剂量组大鼠的日食量增加（P＜0.05）。以上结果说明，柴胡醇提物能显著提高模型大鼠的日食量，并呈现一定的剂量依赖关系。

如表3所示，与正常对照组比较，给药16天后，模型对照组大鼠的日水量显著降低（P＜0.01），柴胡醇提高、中、低剂量组和复方鳖甲软肝片组、秋水仙碱组大鼠的日水量显著降低（P＜0.05），给药21天后，模型对照组大鼠的日水量显著降低（P＜0.001），柴胡醇提中低剂量组大鼠的日水量显著降低（P＜0.05），柴胡醇提低剂量组大鼠的日水量显著降低（P＜0.01）；与模型对照组比较，给药16天后，柴胡醇提高剂量、复方鳖甲软肝片组、秋水仙碱组大鼠的日水量增加（P＜0.05），给药21天后，柴胡醇提高剂量组、复方鳖甲软肝片组和秋水仙碱组大鼠的日水量增加（P＜0.01），柴胡醇提中、低剂量组大鼠的日水量增加（P＜0.05）。以上结果说明，柴胡醇提物能显著提高模型大鼠的日水量，并呈现一定的剂量关系。

表1 柴胡醇提物对改良法肝纤维化大鼠体质量的影响（±s，n=10）

表1 柴胡醇提物对改良法肝纤维化大鼠体质量的影响（±s，n=10）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；与模型对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。

组别剂量/g·kg-1d0/g d1/g d6/g d11/g d16/g d21/g正常对照组—294.2±16.7 298.7±18.0 318.3±16.2 347.2±17.3 374.7±15.3 405.1±16.1模型对照组—295.4±16.1 299.3±16.2 304.0±17.8 323.5±17.5*349.1±15.7**366.2±19.6***柴胡醇提高剂量组3.60 291.3±11.7 294.9±11.4 308.5±13.2 335.1±10.5 360.4±8.2#382.3±12.6*##柴胡醇提中剂量组1.80 288.5±17.8 292.2±18.2 305.9±11.4 331.3±12.8 357.5±14.8*#376.6±16.6*##柴胡醇提低剂量组0.90 291.1±14.2 295.3±14.3 304.7±17.6 326.4±16.6 353.7±18.0*370.0±16.2**#复方鳖甲软肝片组1.08 290.6±20.7 293.4±19.6 309.8±23.8 330.1±19.6 358.8±19.7#381.3±15.4*##秋水仙碱组0.18 294.4±215.0 300.1±14.0 312.5±18.8 335.3±19.8 360.1±16.7#384.7±14.4*##

表2 柴胡醇提物对改良法肝纤维化大鼠日食量的影响（s，n=10）

表2 柴胡醇提物对改良法肝纤维化大鼠日食量的影响（s，n=10）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；与模型对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。

组别剂量/g·kg-1d0/g d1/g d6/g d11/g d16/g d21/g正常对照组—24.4±0.5 26.1±0.8 28.2±1.2 29.3±0.8 33.1±0.5 34.6±1.6模型对照组—24.1±0.2 24.3±0.8 25.1±0.2 26.5±1.0*29.1±0.4**30.0±1.5***柴胡醇提高剂量组3.60 24.0±0.1 23.2±1.5 26.9±0.7 28.4±0.2 31.2±0.5#32.4±1.8*##柴胡醇提中剂量组1.80 24.0±1.0 24.1±1.3 25.9±0.8 27.5±0.5 30.6±0.8 33.1±2.1*##柴胡醇提低剂量组0.90 23.9±1.1 23.3±1.1 25.4±1.3 27.2±1.3*29.6±1.9*32.1±2.8**#复方鳖甲软肝片组1.08 23.9±0.7 22.4±0.6* 24.6±0.2 28.0±0.8 30.8±0.4#32.6±1.0*##秋水仙碱组0.18 24.0±1.2 24.2±0.7 25.4±1.8 28.8±0.3 31.1±0.2#33.5±0.4*##

表3 柴胡醇提物对改良法肝纤维化大鼠日水量的影响（±s，n=10）

表3 柴胡醇提物对改良法肝纤维化大鼠日水量的影响（±s，n=10）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；与模型对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。

组别剂量/g·kg-1d0/g d1/g d6/g d11/g d16/g d21/g正常对照组—29.7±1.1 29.6±1.2 32.7±1.0 33.6±1.1 38.4±2.0 44.3±7.3模型对照组—30.1±1.2 30.2±1.0 31.0±0.8 31.8±0.9 32.8±0.8**36.0±6.6***柴胡醇提高剂量组3.60 28.7±1.6 29.3±1.4 30.3±1.2 32.4±0.1 35.0±0.2*#42.2±2.0##柴胡醇提中剂量组1.80 29.6±1.3 29.9±0.2 31.1±1.1 32.3±0.6 34.2±1.3*39.7±1.3*#柴胡醇提低剂量组0.90 29.6±1.4 29.9±0.9 30.4±0.5 31.8±0.7 33.0±0.7*37.6±4.2**#复方鳖甲软肝片组1.08 30.8±1.1 31.4±0.3 31.4±0.1 32.2±0.2 35.1±0.9*#42.2±1.7##秋水仙碱组0.18 29.8±1.2 30.7±2.1 31.5±2.0 31.8±1.6 35.9±1.3*#43.1±2.3##

3.4 柴胡醇提物对大鼠中医证候积分的影响

如表4所示，根据肝郁证大鼠证候积分表[10]，对各组大鼠的症状进行观察、积分。正常组大鼠活动正常，饮食饮水正常，未见明显异常行为，造模组大鼠出现倦怠、眼睛无神、呼吸急促、腹部肿胀，耳朵、尾部有瘀斑等，与正常对照组比较，给药1天后，模型对照组和柴胡醇提低剂量组大鼠的证候积分升高（P＜0.05），给药6天、11天、16天、21天后，各组大鼠的证候积分升高（P＜0.001）；与模型对照组比较，给药6天后，柴胡醇提高、中剂量组和复方鳖甲软肝片组大鼠的证候积分降低（P＜0.05），秋水仙碱组大鼠的证候积分降低（P＜0.01），给药11天后，柴胡醇提高、中剂量组、复方鳖甲软肝片组和秋水仙碱组大鼠的证候积分降低（P＜0.01），给药16天后，柴胡醇提高、中剂量组和复方鳖甲软肝片组、秋水仙碱组大鼠的证候积分降低（P＜0.01），柴胡醇提低剂量组大鼠的证候积分降低（P＜0.05），给药21天后，柴胡醇提高剂量组、复方鳖甲软肝片组和秋水仙碱组大鼠的证候积分降低（P＜0.001），柴胡醇提中剂量组大鼠的证候积分降低（P＜0.01），柴胡醇提低剂量组大鼠的证候积分降低（P＜0.05）。详见表5。

3.5 柴胡醇提物对肝纤维化大鼠血中生化指标的影响

如表6所示，与正常对照组比较，模型对照组大鼠血中HA、LN、PCIII、IV-C含量均显著升高（P＜0.001），TGF-β1含量显著升高（P＜0.01），柴胡醇提低剂量组大鼠血中HA、LN、PCIII、IV-C、TGF-β1含量均显著性增高（P＜0.05）；与模型对照组比较，柴胡醇提高、中剂量组和复方鳖甲软肝片组、秋水仙碱组大鼠血中HA、LN水平显著降低（P＜0.001），柴胡醇提低剂量组大鼠血中HA水平显著降低（P＜0.05），柴胡醇提低剂量组大鼠血中LN水平显著降低（P＜0.01），柴胡醇提高、复方鳖甲软肝片组和秋水仙碱组大鼠血中PCIII、IV-C水平显著降低（P＜0.001），柴胡醇提中剂量组大鼠血中PCIII、IV-C水平显著降低（P＜0.01），柴胡醇提低剂量组大鼠血中PCIII、IV-C水平显著降低（P＜0.05），柴胡醇提高、复方鳖甲软肝片组和秋水仙碱组大鼠血中TGF-β1含量显著降低（P＜0.01），柴胡醇提中剂量组大鼠血中PCIII、IV-C水平显著降低（P＜0.05）。说明柴胡醇提物能显著降低肝纤维化大鼠血中指标含量，改善大鼠的肝纤维化程度，其药效作用强度呈现一定的剂量关系。

3.6 柴胡醇提物对肝纤维化大鼠伴随毒副作用血清指标的影响

如表7所示，与正常对照组比较，模型对照组大鼠血中ALT、AST含量显著升高（P＜0.001），柴胡醇提高剂量组大鼠血中ALT、AST含量显著升高（P＜0.01），柴胡醇提低剂量组大鼠血中ALT、AST含量显著升高（P＜0.05），模型对照组大鼠血中BUN、Cr含量显著升高（P＜0.05），其余组大鼠血中BUN、Cr含量升高，无统计学意义；与模型对照组比较，柴胡醇提高剂量组大鼠血中ALT、AST含量显著降低（P＜0.05），柴胡醇提中、低剂量组大鼠血中ALT、AST含量显著降低（P＜0.01），复方鳖甲软肝片组和秋水仙碱组大鼠血中ALT、AST含量均显著降低（P＜0.001）。说明柴胡醇提物在发挥抗肝纤维化药效的同时伴随一定的肝、肾毒副作用，以肝脏为主。

表4 适用于肝郁证特点的模型大鼠证候积分评价量表

表5 柴胡醇提物对改良法肝纤维化大鼠证候积分的影响（±s，n=10）

表5 柴胡醇提物对改良法肝纤维化大鼠证候积分的影响（±s，n=10）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；与模型对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。

组别剂量/g·kg-1d0/g d1/g d6/g d11/g d16/g d21/g正常对照组—0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.20±0.10 0.00±0.00 0.20±0.15模型对照组—0.00±0.00 0.40±0.52*3.90±0.99***5.20±1.03***5.90±1.14***6.50±0.85***柴胡醇提高剂量组3.60 0.00±0.00 0.30±0.52 2.70±0.64***#3.60±0.57***##4.35±0.67***##4.50±0.48***###柴胡醇提中剂量组1.80 0.00±0.00 0.30±0.48 2.90±0.78***#3.81±0.51***##4.40±0.71***##4.90±0.67***##柴胡醇提低剂量组0.90 0.00±0.00 0.40±0.52*3.10±0.89***4.30±0.83***4.90±0.57***#5.10±0.57***#复方鳖甲软肝片组1.08 0.00±0.00 0.30±0.52 2.70±0.68***#3.50±0.67***##4.42±0.84***##4.60±0.52***###秋水仙碱组0.18 0.00±0.00 0.30±0.48 2.60±0.57***##3.40±0.63***##4.20±0.72***##4.30±0.54***###

表6 柴胡醇提物对改良法肝纤维化大鼠血中生化指标的影响（±s，n=10）

表6 柴胡醇提物对改良法肝纤维化大鼠血中生化指标的影响（±s，n=10）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；与模型对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。

组别剂量/g·kg-1HA/ng·L-1LN/μg·L-1PCIII/μg·L-1IV-C/μg·L-1TGF-β1/ ng·L-1正常对照组—28.41±0.55 44.79±1.75 2.24±0.27 5.31±0.35 52.7±5.34模型对照组—41.47±2.11***54.32±2.41***3.50±0.51***7.77±0.73***64.4±8.73**柴胡醇提高剂量组3.60 30.16±1.37###45.34±1.17###2.29±0.17###5.67±0.41###53.8±7.51##柴胡醇提中剂量组1.80 33.69±1.26###46.50±2.13###2.40±0.22##5.93±0.31##55.9±8.53#柴胡醇提低剂量组0.90 35.43±1.74*#47.74±1.95*##2.66±0.26*#6.05±0.53*#60.7±7.97*复方鳖甲软肝片组1.08 31.55±1.46###46.26±2.74###2.28±0.26###5.78±0.50###53.4±4.41##秋水仙碱组0.18 30.05±0.86###45.09±2.74###2.25±0.16###5.59±0.44###54.6±7.87##

表7 柴胡醇提物对改良法肝纤维化大鼠血中肝肾功能指标的影响（±s，n=10）

表7 柴胡醇提物对改良法肝纤维化大鼠血中肝肾功能指标的影响（±s，n=10）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；与模型对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。

组别剂量/g·kg-1ALT/IU·L-1AST/IU·L-1BUN/mmol·L-1Cr/μmol·L-1正常对照组—42.97±5.10 101.2±16.6 9.07±0.62 53.36±2.68模型对照组—86.92±9.84***186.1±12.0***10.16±1.46*57.47±3.82*柴胡醇提高剂量组3.60 72.26±6.56**#145.8±16.7**#9.75±0.54 56.49±3.37柴胡醇提中剂量组1.80 53.88±9.25##123.1±15.2##9.34±0.33 55.05±2.91柴胡醇提低剂量组0.90 66.29±7.51*##137.6±13.6*##9.47±1.08 55.50±2.74复方鳖甲软肝片组1.08 51.66±5.10###123.6±14.2###32.55±1.46 54.62±1.46秋水仙碱组0.18 46.29±4.60###120.0±12.7###9.38±0.65 53.96±1.46

3.7 柴胡醇提物对大鼠脏器系数的影响

如表8所以，与正常对照组比较，模型对照组大鼠肝脏系数显著增大（P＜0.01），脾系数增大（P＜0.05），胸腺系数无显著性变化；与模型对照组比较，柴胡醇提高剂量组、复方鳖甲软肝片组和秋水仙碱组大鼠肝脏系数显著增大（P＜0.01），柴胡醇提中剂量组大鼠肝脏系数显著增大（P＜0.05），柴胡醇提高剂量组、复方鳖甲软肝片组和秋水仙碱组大鼠脾系数显著增大（P＜0.05），其余组无统计学意义。说明柴胡醇提物可抑制大鼠肝脏系数的增大，并呈现一定的剂量关系。

3.8 柴胡醇提物对大鼠肝脏病理组织学检查的影响

柴胡醇提物对肝纤维化大鼠的肝脏组织Riddit分析病理分级结果如表9所示，正常对照组大鼠肝脏细胞结构正常；模型对照组大鼠肝组织损伤严重，出现胶原纤维延伸、肝小叶结构破坏等病理现象，与正常对照组比较，模型对照组大鼠肝组织损伤严重（P＜0.001）；与模型对照组比较，柴胡醇提高剂量组、复方鳖甲软肝片组和秋水仙碱组大鼠肝损伤程度减轻（P＜0.01），柴胡醇提中、低剂量组大鼠肝损伤程度减轻（P＜0.05）。说明柴胡醇提物可改善大鼠肝组织损伤程度，且量效关系良好（病理图见图1）。

4 讨论

表8 柴胡醇提物对改良法肝纤维化大鼠脏器系数的影响（±s，n=10）

表8 柴胡醇提物对改良法肝纤维化大鼠脏器系数的影响（±s，n=10）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；与模型对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001

组别剂量/g·kg-1肝/%脾/%胸腺/%正常对照组—3.14±0.32 0.27±0.05 0.17±0.06模型对照组—4.27±0.94**0.34±0.09*0.15±0.03柴胡醇提高剂量组3.60 3.50±0.34##0.28±0.06#0.16±0.03柴胡醇提中剂量组1.80 3.79±0.69#0.30±0.10 0.16±0.06柴胡醇提低剂量组0.90 4.01±0.90 0.29±0.07 0.15±0.04复方鳖甲软肝片组1.08 3.55±0.39##0.29±0.03#0.17±0.04秋水仙碱组0.18 3.50±0.30##0.29±0.05#0.17±0.06

表9 柴胡醇提物对大鼠肝脏的病理影响（±s，n=10）

表9 柴胡醇提物对大鼠肝脏的病理影响（±s，n=10）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；与模型对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。

组别剂量/g·kg-1病理分级病理积分I II III IV V正常对照组—10 0 0 0 0 0.0±0.0模型对照组—4 2 2 1 1 1.3±1.4***柴胡醇提高剂量组3.60 7 1 2 0 0 0.5±0.8##柴胡醇提中剂量组1.80 6 2 2 0 0 0.6±0.8#柴胡醇提低剂量组0.90 6 2 1 1 0 0.7±1.1#复方鳖甲软肝片组1.08 7 2 1 0 0 0.4±0.7##秋水仙碱组0.18 7 3 0 0 0 0.3±0.5##

图1 大鼠肝组织Masson染色（200×）

目前，在抗肝纤维化药物研究过程中建立了多种肝纤维化动物模型，但各有利弊，其中，免疫性大鼠肝纤维化模型病理机制比较接近人类肝的纤维化[13]。本文采用动物血清作为抗原反复注射，在此基础上以高脂高热量饲料诱导，结合酒精刺激，综合上述多种因素，加速肝纤维化的形成。这种肝纤维化模型动物同时具备疾病与证候双重特征，既复制出了符合中医证的基本特点，又与西医肝纤维化病理特征相一致。能够更准确地模拟临床疾病与证候形成的病理机制及病变过程。通过给予柴胡有效组分，既证明了该动物肝纤维化模型的可靠性，又证实了药物对该病的安全性和可靠性。

肝组织内细胞外基质异常沉积是肝纤维化形成的主要病理特征，血清肝纤维化指标主要有细胞外基质（Extracellular Matrix，ECM）及其裂解物、ECM代谢相关的酶等[14]，他们对肝纤维化的合成、降解起着关键性作用。ECM主要成分包括HA、LN、IV-C、PCIII，作为肝纤四项，其主要用来检查诊断慢性肝病患者病情发展状况和治疗效果，衡量炎症活动度、纤维化程度的重要依据[15,16]。HA是基质成分之一，由间质细胞合成，可以准确、灵敏地反映肝内已产生的纤维量及肝细胞受损状况，是肝纤维化和肝硬变的敏感指标。LN与肝纤维化活动程度及门静脉压力呈正相关，可反映肝纤维化的进展与严重程度。IV-C反映基底膜胶原更新率，含量增高不仅可以灵敏反映出肝纤过程，还与肝纤维化肝内炎性反应及坏死程度有关[17]，是肝纤的早期标志之一。血清PCIII水平与肝纤维化病变程度呈密切相关，反映肝纤维合成状况和炎症活动性。彭岳等[18]通过检测血中HA、LN、IV-C、P3NP等指标的含量，证实肝纤维化模型的建立，因此，本研究采用检测血清中HA、LN、PCIII、IV-C等指标，证实了大鼠肝纤维化的形成。AST和ALT可以反映肝脏细胞受损及慢性炎性反应[19]，BUN、Cr可以反映肾细胞受损情况，通过检测ALT、AST、BUN、Cr含量变化，证实柴胡的毒副作用。

实验研究发现，造模结束后证候积分表显示：模型组大鼠出现精神倦怠，眼睛暗红，尾部瘀斑，粪便稀溏等现象，说明大鼠肝纤维化造模成功，血清指标ALT、AST水平升高，说明大鼠肝脏出现明显损伤，肝纤四项HA、LN、PCIII、IV-C水平升高，进一步证明大鼠肝纤维化模型形成。大鼠Masson染色图显示，大鼠肝脏出现胶原纤维增生，肝小叶结构破坏等病理现象。综上所述，说明大鼠肝纤维化模型造模成功。连续给予0.90-3.60 g·kg-1的柴胡醇提物可改善大鼠生长状况，显著降低血中ALT、AST、HA、LN、PCIII、IV-C等肝功能指标水平，能够明显改善复合因素所致的大鼠肝纤维化程度，并呈现一定的剂量依赖性。柴胡抗肝纤维化作用可能与其能减轻和修复肝细胞损伤、抑制肝细胞纤维化的形成与发展有关。研究发现[20]，柴胡能抑制肝星状细胞胶原蛋白的分泌，进而抑制肝纤维化程度。其中柴胡皂苷是柴胡发挥疏肝解郁的主要物质基础[21]，柴胡皂苷d通过下调肝纤维化大鼠肝组织中TGF-β1mRNA和蛋白的表达水平，发挥抗肝纤维化的药效[22]。柴胡在发挥抗肝纤维化药效的同时会产生一定的毒副作用，主要以肝脏为主，主要表现为柴胡醇提高剂量组血ALT、AST水平升高，高于柴胡中、低剂量组，说明柴胡在发挥保肝作用的基础上，同时对肝脏具有一定的毒副作用。血BUN、Cr水平升高，提示柴胡对肾脏有一定的毒副作用，且柴胡醇提组分发挥抗纤维化药效伴随毒副作用的剂量为3.60 g·kg-1，为柴胡的研究提供数据支撑，柴胡抗肝纤维化作用机制和毒性作用机制有待于后续深入研究。

1 中华人民共和国药典委员会. 中国药典一部. 北京:中国医药科技出版社, 2010: 263-264.

2 杨柳,王雪莹,刘畅,等. 北柴胡化学成分与药理作用的研究进展.中医药信息, 2012, 29(3): 143-144.

3 陈亚双, 孙世伟. 柴胡的化学成分及药理作用研究进展.黑龙江医药, 2014, 27(3): 630-633.

4 李仁国. 柴胡有效成分及药理作用分析. 陕西中医, 2013, 34(6): 750-751.

5 李晋,徐尚福,金凤,等. 小柴胡汤下调JAK2,STAT3的表达治疗大鼠肝纤维化.中国实验方剂学杂志, 2014, 20(18): 118-122.

6 尚立芝,季书,王琦,等. 柴胡疏肝散的抗肝纤维化作用研究. 中药药理与临床, 2014, 30(5): 8-11.

7 黄伟,孙蓉,尹建伟,等. 南、北柴胡不同组分对小鼠急性毒性试验比较研究. 中国药物警戒, 2010, 07(8): 454-457.

8 孙蓉,吕丽莉,王丽,等. 柴胡致大鼠肝毒性氧化损伤机制研究.中药药理与临床, 2009, 25(1): 49-51.

9 何燕,胡志峰,李平,等. 柴胡皂苷d抗肝纤维化大鼠脂质过氧化作用的研究. 中国中药杂志, 2008, 33(08): 915-919.

10 窦立雯,孙晓倩,李晓宇,等. 柴胡水提成分对改良法肝纤维化大鼠的预防作用研究. 中国药物警戒, 2015, 12(10): 577-581.

11 中华人民共和国卫生部药典委员会. 中华人民共和国药典(第一部).北京:化学工业出版社, 2010.

12 吴茜玉. 鸡骨草胶囊对大鼠免疫性肝纤维化的治疗作用. 中国医药指南, 2010, 9(8): 46-48.

13 胡荣昕,缪伟峰. 肝纤维化动物模型的研究概况. 实用肝脏病杂志, 2007, 10(2): 133-135.

14 潘爱萍,林英辉,潘元平,等. 肝纤维化血清学标志物与肝脏病理相关性研究. 南方医科大学学报, 2007, 27(12):1935-1936,1938.

15 Novo E, di Bonzo L V, Cannito S, et al. Hepatic myofibroblasts: a heterogeneous population of multifunctional cells in liver fibrogenesis. Int J Biochem Cell Biol, 2009, 41(11): 2089-2093.

16 孙宇, 姜美凤. “肝纤四项”检测在肝纤维化诊断中的价值. 实用临床医药杂志, 2011, 15(7): 140-141.

17 田玉玲,陈耀宇,雷力民. 血清肝纤维化3项指标对肝脏疾病的检测. 检验医学与临床, 2007, 4(6): 513-514.

18 彭岳,韦燕飞,赵铁建,等. 复合多因素法对血瘀型肝纤维化大鼠模型的建立和评价. 世界科学技术—中医药现代化, 2016, 18(1): 141-149.

19 Rechnagel R O, Glende E A Jr. Carbon tetrachloride hepatotoxicity: an example of lethal cleavage. CRC Cirt Rev Toxicol, 1973, 2(3): 263-297.

20 郑丽娜,韩涛,王宝恩,等. 柴胡对肝星状细胞胶原蛋白分泌的影响.天津医科大学学报, 2001, 7(4): 502-503.

21 黄幼异,黄伟,孙蓉. 柴胡皂苷对肝脏的药理毒理作用研究进展.中国实验方剂学杂志, 2011, 17(17): 298-301.

22 任建琳,王健,胡晔,等. 柴胡皂苷d对免疫性肝纤维化大鼠TGF-β1、HYP、SOD、MDA的影响. 现代预防医学, 2012, 39(12): 3044-3047.

A Study on Liver Fibrosis Efficacy Accompanied by Side Effects of Alcohol Extracts from Bupleurum Chinense

Sun Xiaoqian1,2, Huang Nana2, Dou Liwen2, Li Xiaoyu1, Sun Rong1
(1. Shandong Academy of Chinese Medicine, Jinan 250014, China;
2. College of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China)

In this study, the model of rats’ liver fibrosis was established to examine the protective effect of alcohol extracts of B. chinense, which aimed to provide experimental evidence behind the relationship of its“toxicity-effect”. The model of rats’ liver fibrosis was established through high-fat diet complicated with the administration of alcohol and porcine serum. Meanwhile, rats were respectively given several doses of alcohol extracts of B. chinense and positive medicine for observing their efficacy and assident toxicity. At the same time, general situation was observed, and body weight, daily appetite and water quantity, syndrome integral were measured. The contents of ALT, AST, HA, LN, IV-C, PCIII, TGF-β1, BUN and Cr in serum were tested while the organ indexes were measured and the major organs were scheduled for consideration by the pathology. As a result, giving alcohol extracts of B. chinense ranged from 0.90 g·kg-1to 3.60 g·kg-1for 21 consecutive days obviously improved the diet, drinking and physical activities of rats. The contents of ALT, AST, HA, LN, IV-C and PCIII and liver coefficient declined significantly, and liver fibrosis was also improved. However, the activities of ALT and AST in the high dose of B. chinense were higher than those of other dose groups, and the contents of BUN and Cr in serum increased. In conclusion, alcohol extracts of B. chinense presented an obviously effectiveness on liver fibrosis in rats and a good dose-effect relationship. At the same time, 3.60 g·kg-1of B. chinense extracts had side effects and liver, kidney toxicity, especially in the liver.

Bupleurum chinense, alcohol extracts, liver fibrosis, rat, assident toxicity

10.11842/wst.2016.08.019

R285

A

（责任编辑：马雅静，责任译审：朱黎婷）

2016-07-29

修回日期：2016-08-20

＊ 国家自然科学基金委面上项目（81374059）：柴胡肝毒性与功效、证候关系的基础研究，负责人：孙蓉；山东省科技厅自主创新和成果转化项目（2014ZZCX02104）：药物安全性评价和适宜于抗肿瘤及缺血性脑血管疾病多靶点和复方新药成药性评价关键技术，负责人：孙蓉；山东省自然基金委重点项目（2011ZRB14333）：SSa和SSd生物转化及基于功效的药理活性和肝毒性研究，负责人：孙蓉；山东省泰山学者工程专项经费资助，特聘专家（ts201511107）：孙蓉。

＊＊ 通讯作者：孙 蓉，博士，研究员，博士生导师，主要研究方向：中药药理与毒理。