仔猪抗大肠杆菌性F4ac腹泻病分子遗传机理研究进展

张 婷，廖金龙，柴晶党，叶 丹，欧阳婧

(江西科技师范大学生命科学学院，江西南昌 330013)



仔猪抗大肠杆菌性F4ac腹泻病分子遗传机理研究进展

张 婷，廖金龙，柴晶党，叶 丹，欧阳婧*

(江西科技师范大学生命科学学院，江西南昌 330013)

摘要产肠毒素大肠杆菌F4ac(ETEC F4ac)是引发新生和断奶前仔猪腹泻病的最主要致病菌，分离和鉴别猪ETEC F4ac受体目的基因及因果突变位点成为猪ETEC F4ac腹泻抗病育种的关键。对仔猪抗大肠杆菌性腹泻病分子遗传机理研究进展进行综述，以期为培育种猪抗腹泻病新品系奠定理论基础。

关键词仔猪；ETEC F4ac；遗传机理

新生及断奶仔猪腹泻病是养猪生产中的一种常见疾病，给养猪业带来巨大的经济损失。据报道，在一些养猪业发达的国家，新生仔猪腹泻的发病率高达75.0%[1]。我国仔猪的腹泻发病率也很高，全年平均发病率为46.5%[2]。研究表明，引发新生仔猪腹泻病的致病菌主要是产肠毒素大肠杆菌F4ac(ETEC F4ac)[3]。ETEC F4ac的致病性取决于该致病菌是否与猪小肠上皮细胞表面刷状缘的受体特异性结合。当该致病菌与小肠上皮细胞表面刷状缘结合后，ETEC F4ac大量繁殖产生肠毒素，所产生的肠毒素致使肠上皮细胞分泌功能亢进，大量水和电解质进入肠腔，造成肠腔中大量液体积蓄，超过了肠壁重吸收能力从而引起腹泻。由此可见，仔猪小肠上皮细胞有无ETEC F4ac受体是仔猪被ETEC F4ac感染时是否发病的关键。无受体猪表现为抵抗型，有受体猪则表现为易感型[4]。分离和鉴别猪ETEC F4ac受体目的基因及因果突变位点成为猪ETEC F4ac腹泻抗病育种的关键。笔者对仔猪抗大肠杆菌性腹泻病分子遗传机理研究进展进行了综述，以期为培育种猪抗腹泻病新品系奠定理论基础。

1产肠毒素大肠杆菌(ETEC)亚型

产肠毒素大肠杆菌(ETEC)根据其侵染特点可分为5种亚型，分别为F4、F18、F5、F6和F41，在这5种亚型病原体中，F4和F18是断奶仔猪腹泻的主要致病菌[5]。F18主要引发断奶仔猪水肿病和腹泻病，而F4主要引发新生仔猪及早期断奶仔猪腹泻病[6]。研究表明，ETEC F18的受体基因为FUT1，FUT1基因在307位点处发生了A>G突变，该位点的突变决定了F18能否与受体结合从而导致腹泻[7]。根据免疫学特征将ETEC F4分为ab、ac和ad 3种亚型[8]，在这3种亚型中，F4ac是最主要的致病菌[4]。F4ac有2个分子量分别为210和240 ku的分泌型糖蛋白受体[9]，这2种糖蛋白所含的β-连接的半乳糖是F4ac识别受体分子的重要组成部分。鉴别ETEC F4ac受体基因及其因果突变是目前国际上仔猪抗大肠杆菌性腹泻研究的重点和热点。

2ETEC F4ac受体基因的定位研究

Gibbons等[10]研究表明，猪ETEC F4ac受体为单基因控制，呈显隐性遗传模式。携带显性基因S的仔猪对ETEC F4ac的黏附易感，隐性基因s纯合仔猪则表现为抵抗型。F4ac受体基因的定位和鉴别得到了国内外的重视。

1995年，Edfors-Lilja等[11]利用欧洲野猪×大白猪资源家系群体为材料，经过三代系谱的连锁分析，将ETEC F4ac受体定位于13号染色体，与Tf基因紧密连锁，发现F4ab和F4ac受体位点紧密连锁，但这2个受体却位于不同的位点。2002年，Python等[12]以大白猪和大白×长白三代家系为材料，利用13号染色体的微卫星标记信息，将ETEC F4ac受体进一步定位于S0068和Sw1030之间，与其中的S0075和Sw225高度连锁(θ=0.00)。该研究结果在1年后Jørgensen等[13]开展的基因定位研究中得到了验证，他们还利用FISH和辐射杂种细胞克隆板技术揭示ETEC F4ac受体位于13号染色体q41区(SSC13q41)，分别与人3号染色体的q28～q29和q21区同源。2009～2011年，Joller等[14]、Jacobsen等[15]和Rampold等[16]先后将ETEC F4ac受体进一步定位于5.7～3.1 cM，通过进一步的区间定位最终定位到LMLN-S0283较小区间。

李玉华等[17]利用松辽黑猪和长白猪杂交群为试验群体，开展了ETEC F4黏附表型分布等研究，Niu等[18]利用松辽黑猪和长白猪杂交群，采用增加微卫星标记密度，开展基于家系不平衡检测的精细定位，将F4ac受体基因定位于猪13号染色体S0283和SW1876区域约1.6 cM区间。

Ren等[19]利用自身构建的大规模白色杜洛克×二花脸资源家系群体，通过183个微卫星位点和具有ETEC F4ac体外黏附表型的755个F2个体和390个F3个体开展了全基因组连锁分析、IBD分析及断点重组分析，将ETEC F4ac受体基因精细定位于13号染色体q41区(SSC13q41)临近S0283的约3.5 cM区域。通过全基因组连锁定位分析和目的区域的重组断点事件分析，将目标区域缩小至UMNp595与 ALGA0072095之间2.3 Mb区域。以上工作推动了仔猪ETEC F4ac受体基因的研究进展。

3ETEC F4ac受体位置候选基因研究

鉴别SSC13q41区域的位置候选基因是目前ETEC F4ac受体研究的重点。大量免疫生化特性研究表明，黏蛋白型唾液糖蛋白(IMTGP)、74 ku的转铁蛋白(GV74)和小肠中性糖鞘H(mLad)符合ETEC F4ac受体的理化特征，其中黏蛋白型唾液糖蛋白与F4ab 和F4ac结合，但不与F4ad结合，且该糖蛋白的存在与新生仔猪对ETEC F4ab或F4ac的敏感性高度相关[5]，因而成为ETEC F4ac受体候选基因选择的重要依据。Kreuzev等[20]在获得ETEC F4ac受体基因染色体定位信息后，选择黏附素糖蛋白编码基因(MUC基因家族)和转铁蛋白受体基因(TFRC)进行研究，Python等[12]对TFRC、B3GnT5、B4GALT4和B4GALT4 4个基因进行了研究，但未发现与F4ac黏附表型显著相关的候选基因和标记。

Jørgensen等[13]在欧洲野猪×大白猪资源家系群体中，发现了Mucin4基因内含子7的一个SNP标记与ETEC F4ac的黏附表型共分离。Peng等[21]与Jørgensen等[13]就该位点的影响效应开展了合作科研，发现该标记在所构建的白色杜洛克×二花脸资源家系始祖动物中无多态性，而Peng等[21]的家系F2个体中有充分分离的ETEC F4ac黏附表型，这表明该SNP标记只与ETEC F4ac受体基因因果突变(causative mutation)呈一定连锁不平衡的分子标记，不能解释所有群体的ETEC F4ac受体遗传基础。

在精细定位基础上，Ren等[19]构建了包括20个功能基因座位的SSC13q41人-猪高分辨率比较基因图谱，并先后对该区域内的黏附素13(MUC13)、黏附素20(MUC20)和转铁蛋白(TFRC)3个位置候选基因开展了研究，虽获得了一些可喜的结果，但未鉴别到与ETEC F4ac易感/抗性表型共分离的多态位点。Huang等[22]利用比较基因组法在该区域的黏附素4(MUC4)基因中开发了一个STS(sequence tagged site)，并在位于内含子区鉴别到一个与ETEC F4ac易感/抗性虽非共分离但呈强相关的SNP位点。

笔者采用猪60K芯片，利用其中39720个有效SNPs开展全基因组关联分析结合连锁与连锁不平衡分析，揭示MUC13基因为最可能的目的基因。在包括MUC13基因的2.3 Mb区域进一步搜寻和鉴别了193个SNPs标记，利用这些标记在已经黏附表型测定的分布于10省(市)12个中国地方猪种和3个西方商业猪种共292个无相关个体中开展关联分析，结果支持MUC13基因为目的基因。针对MUC13基因进一步试验表明，MUC13基因编码2个转录本(MUC13A 和MUC13B)，2个转录本对应的等位基因MUC13A和MUC13B之间的差别在于其第2外显子所含的高度串联重复区和侧翼的内含子68 bp缺少，利用内含子68 bp缺少差异作为标签标记，在大样本无相关个体中进行分析，结果表明，所有124 头对F4ac抗性个体均为MUC13A纯合子，而所有对F4ac易感的594头猪至少含有一个MUC13B等位基因，进一步支持了MUC13为目的基因[23]。

Ren等[19]进一步通过qRT-PCR试验发现MUC13基因的表达量与黏附表型无关，由此推断MUC13基因的因果突变属于引起MUC13基因功能改变的编码突变。进一步对除MUC13基因高GC含量、高度串联重复的PTS区(富含脯氨酸、苏氨酸和丝氨酸的区域)外的所有基因区域进行SNPs搜寻，鉴别到22个cSNPs和55个内含子突变，将这些SNPs在远缘群体中开展关联分析，结果无一个与表型共分离SNP。由此推断MUC13基因的因果突变极有可能位于高度串联重复的PTS区。另外根据MUC型家族其他成员的研究，高度串联重复的PTS区构成MUC的糖基化结合位点，该位点赋予MUC重要的生物功能，因此，串联重复的数目、长度及序列变异都将影响到糖基化的程度及类型，由此影响MUC蛋白的功能。由此可以判断MUC13基因的因果突变位于高度串联重复的PTS区。

Fu等[24]开展了基于GWAS分析的ETEC F4ac受体基因精细定位，将目标区域定位至2.6 Mb区域，进一步确定该区域中的TNK2、ZNF148、HEG1、MUC13 和ITGB5 为最有可能的位置候选基因。Zhou等[25]将ETEC F4ac受体最重要的候选基因ITGB5和MUC13采用基因沉默策略开展功能分析，进一步证实了ITGB5和MUC13基因在ETEC 黏附过程中发挥重要的作用。

Goetstouwers等[26]以大白、比利时长白以及大白与比利时长白的杂交猪种为研究对象，通过体外ETEC的鞭毛黏附性试验以及全基因组关联性分析，发现ETEC F4ac 的受体可能位于MUC13基因的邻近区域。

4展望

虽然目前仔猪抗ETEC F4ac腹泻目的基因鉴别取得了重大突破，对多个位置候选基因尤其是MUC13基因也开展了许多卓有成效的试验，仍有以下尚未解决的关键问题：①真正的目的基因及其因果突变位点(causative mutation)尚未鉴别到；②因果突变位点功能分析尚未进行；③因果突变位点的遗传起源进化也有待研究。因而对于真正解析猪F4ac腹泻病分子机理而言，尚需开展大量深入的研究。可以采用现代分子生物学技术如通过目标区域捕获测序或长片段扩增子测序等技术结合功能分析策略鉴别到目的基因及其因果突变位点，深入解析其分子机理及遗传进化，进而全面揭示猪F4ac侵染腹泻的抗病分子遗传机理，为培育种猪抗腹泻病新品系奠定理论基础。

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基金项目江西省自然科学基金项目(20143ACB21006 )；江西省教育厅科技项目(GJJ14571)；江西科技师范大学大学生创业、科研基金项目(20140801007，20140804075)。

作者简介张婷(1988- )，女，山东泰安人，硕士研究生，研究方向：分子遗传学。*通讯作者，教授，博士，硕士生导师，从事分子抗病遗传育种研究。

收稿日期2016-03-22

中图分类号S 852.6

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)13-144-02

Research Progress of the Molecular Genetic Mechanism Resistant to ETEC Diarrhea Disease in Piglet

ZHANG Ting, LIAO Jin-long, CHAI Jing-dang, OUYANG Jing*et al

(College of Life Science, Jiangxi Science & Technology Normal University, Nanchang, Jiangxi 330013)

AbstractEnterotoxigenic Escherichia coli F4ac (ETEC F4ac) were major causes of diarrhea in piglets. Therefore, identification and isolation of piglet ETEC F4ac Receptor genes and causal mutations were the keys to diarrhea disease resistance breeding of piglet ETEC F4ac. In this research, the research progress on the molecular genetic mechanism resistant to ETEC diarrhea disease in piglet was reviewed, aiming at providing references for the research on new lines cultivation of anti-diarrhea piglet.

Key wordsPiglet; ETEC F4ac; Genetic mechanism