蚯蚓抗菌肽的研究进展

李 娟， 吴永胜， 杨 雪， 邱时秀， 许祯莹， 雷春龙， 孙越鸿， 齐桂兰

(成都市农林科学院畜牧研究所，四川成都 611130)



蚯蚓抗菌肽的研究进展

李 娟， 吴永胜， 杨 雪， 邱时秀， 许祯莹， 雷春龙， 孙越鸿， 齐桂兰

(成都市农林科学院畜牧研究所，四川成都 611130)

摘要抗菌肽是一类广泛存在于自然界生物体中的小肽类物质，是机体先天性免疫系统的重要组成部分。由于其具有分子质量小和抗菌谱广等特点以及不同于抗生素的全新的抗菌机制，在药物开发领域和畜禽饲料添加剂等领域具有广阔的应用前景。蚯蚓抗菌肽种类多，具有良好的抑菌效果。对蚯蚓抗菌肽的分类、功能及其在生产中的应用研究进展进行了综述。

关键词蚯蚓；抗菌肽；抑菌效果；应用

Research Progress of Earthworm Antibacterial Peptide

LI Juan,WU Yong-sheng,YANG Xue et al (Institute of Animal Science,Chengdu Academy of Agriculture and Forestry Sciences,Chengdu,Sichuan 611130)

Abstract Antibacterial peptide is a small peptides widely distributed in the organisms in nature.It is an important part of the innate immune system.Due to characteristics of small molecular weight and broad antifungal spectrum,antibacterial peptide has wide application prospect in the fields of drug development,livestock and poultry feed additives.There are many kinds of earthworm antibacterial peptides,which have relatively good bacteriostat.In this research,the research progress of the classification and function of earthworm antibacterial peptides was briefly reviewed,as well as its application in production

Key wordsEarthworm; Antibacterial peptide; Bacteriostatic effect; Application

抗菌肽(Antibacterial peptide,ABP)，又称抗微生物肽(Antimicrobial peptide,AMP)或肽抗生素(Peptide antibiotics)。世界上第一个被发现的抗菌肽是1980年由瑞典科学家G.Boman等经过注射阴沟通杆菌及大肠杆菌诱导惜古比天蚕蛹而产生的具有抗菌活性的多肽，定名为Cecropins。由于这类活性多肽对细菌具有广谱高效杀菌活性，随着抗生素耐药微生物的涌现，越来越多的生产厂家期望应用安全无毒的抗菌剂，使得抗菌肽在医药行业和饲料添加剂等领域应用前景十分广阔[1]。

据报道，广东有研究人员将生产的抗菌肽酵母制剂用作饲料添加剂来治疗仔猪白痢和雏鸡白痢，取得明显效果，并成功通过中试[2]。蚯蚓通常生活在充满大量致病微生物的环境，生命力强且极少患病，因其具有经过长期进化而形成的抵抗外来微生物侵袭的机制。人们采用现代生物技术从蚯蚓中分离到多种生物活性成分，如抗菌肽、免疫球蛋白、纤溶酶、纤溶酶原激活剂、抗氧化酶系和抗肿瘤成分等[3]。蚯蚓抗菌肽种类多，抑菌效果好，在饲料添加剂等领域中应用前景广阔。笔者对蚯蚓抗菌肽的分类、功能及其在生产中的应用研究进展进行了综述。

1蚯蚓抗菌肽的分类

1.1金属蛋白Dhainaut等[4]在蚯蚓体腔G1粒细胞中分离到2个10 ku的亚基组成的二聚体蛋白，这种蛋白与镉结合蛋白结构极其相似，是一种能抑制大肠杆菌和微球菌的金属抗菌蛋白。

1.2蚯蚓体内具有溶血作用的抑菌蛋白Valembois等[5]报道蚯蚓体腔液中的溶血蛋白和抑菌蛋白为同一种分子量的脂蛋白。张阳等[6]采用凝胶层析和离子交换层析纯化，得到一种蚯蚓体腔液蛋白，其分子量约为38.6 ku，比浊抑菌试验表明，低浓度受试样品作用大肠杆菌1 h出现抑制效果，作用金黄色葡萄球菌3 h出现抑制效果，表明该样品具有一定抑制细菌生长的活性；此外，研究发现该蛋白还具有较强的溶解鸡红细胞的作用，溶解红细胞的最低浓度为0.39 μg/mL，说明此蛋白的生物活性可能是通过破坏细胞结构而实现。

1.3不具有溶血特性的抗菌蛋白

1.3.1Lumbricin I。Cho等[7]采用亲和层析和反相HPLC技术从蚯蚓中分离纯化出一种新型的抗菌肽Lumbricin I，这种抗菌肽是含脯氨酸的62的氨基酸的肽类，分子量为7 231 u，cDNA序列分析证明其为一种76氨基酸的前体形式，在体外试验中表现出广谱抗微生物活性，而不会溶血；序列中的第6~34位残基分离的29氨基酸肽还显示出比Lumbricin I具有更强的抗菌活性，称为Lumbricin I(6-34)，而且其Lumbricin 基因mRNA表达具有特异性，只在成年蚯蚓体内检测到，而在幼蚓和蚓卵中均无表达。赵晓瑜等[8]研究发现人工合成的Lumbricin I(6-34)也称为蚯蚓29肽，具有广谱性，能够有效抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等常见细菌，同时还能够抑制酿酒酵母、露湿漆斑菌、总状毛霉等真菌；蚯蚓29肽活力高，当质量浓度为9 mg/L时对大肠杆菌有明显的抑制效果；蚯蚓29肽稳定性强，在pH为2.2或11.0的环境中抑菌活性不变，而且在煮沸10 min后仍能保留80%以上的活性。李国建[9]构建了融合表达载体pGEX-4T-2-29aa和非融合表达载体pBV221-29aa。 SDS-PAGE结果表明，2个载体分别表达了融合的GST-29肽和游离的29肽产物。融合蛋白GST-29肽经凝血酶作用去掉GST标签后的游离29肽没检测到具有抑菌活性，可能由于切点处多了2个氨基酸影响到29肽的活性结构。非融合载体表达的游离29肽产物以包涵体形式存在，虽然表达量不高，但是复性后表现出抑菌活性。

1.3.2Fetidins。Fetidins是由蚯蚓的黄体细胞分泌的2种有抑菌活性的蛋白，其表观分子量分别为40和45 ku，是蚯蚓体腔液的主要组分，占其总蛋白量的20%左右，能够抑制病原菌嗜水性单胞菌、巨大芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和柑橘类支原体柠檬螺旋体的生长[10]。

2蚯蚓抗菌肽抑菌效果的影响因素

2.1分子量对蚯蚓抗菌肽抑菌效果的影响刘艳琴等[11]分离到由几个氨基酸组成的分子量小于1 ku的寡肽类，研究发现蚯蚓寡肽通过抑制PRV的复制起到抑制PRV引起的细胞病变的作用。王庄等[12]从蚯蚓体内分离纯化30 ku以下的抗菌肽，通过电击诱导蚯蚓产生抗菌肽、超滤浓缩脱盐以及截取3~30 ku的抗菌肽、用阳离子交换分离提纯得到分子量为3~30 ku的蚯蚓抗菌肽，发现分子质量在5.856~7.823 ku的蚯蚓抗菌肽比分子量为14.40~20.00 ku范围的抑菌效果好。

2.2浓度对蚯蚓抗菌肽抑菌效果的影响王庆华等[13]研究表明蚯蚓抗菌肽的抑菌效果相当于稀释度为1×10-4~1×10-3的硫酸庆大霉素溶液，且随着蚯蚓量的增加，提取物的抑菌效果也相应增加。

2.3pH对蚯蚓抗菌肽抑菌效果的影响郑津辉等[14]研究表明蚯蚓抗菌肽对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有抑制作用，同时证实蚯蚓抗菌肽抗菌性受pH的影响不大。

2.4水解时间对蚯蚓抗菌肽抑菌效果的影响贾久满等[15]对经过4、5、6 h水解的蚯蚓水解液进行离心和过滤，并采用滤纸片法和打孔法测定蚯蚓水解液对大肠杆菌的抑菌效果，结果表明经过5 h水解的蚯蚓水解液对大肠杆菌抑菌效果最好。

3蚯蚓抗菌肽在生产中的应用

赵琴等[16]研究发现巴氏杆菌感染兔48 h后，兔体内的TNF-α和NO含量以感染组最高，饲料中添加3~30 ku蚯蚓抗菌肽低、中、高剂量组次之，对巴氏杆菌具有明显的抑菌效果，高剂量的抑菌效果最为显著，试验表明蚯蚓抗菌肽能提高兔的免疫力。李曾夏子[17]用3~30 ku蚯蚓抗菌肽对兔巴氏杆菌病进行治疗，测定各组试验兔的白细胞、嗜中性白细胞数、体内细菌动态数、TNF-α和NO含量及TLR4的mRNA含量，结果发现蚯蚓抗菌肽能有效刺激免疫反应，在致病初期迅速提高白细胞的增生能力，抑制体内细菌增长并有杀灭作用，并能有效遏制体内炎性因子TNF-α和NO的迅速增长，减轻巴氏杆菌感染所造成的肺部炎性反应损伤。

吴海等[18]研究表明添加0.6%~1.0%的蚯蚓抗菌肽粗品均可以显著降低0~21日龄雏鸡的料肉比。李冬光等[19]在黄鸡日粮中添加蚯蚓抗菌肽对黄鸡生产性能进行研究，结果表明日粮中添加蚯蚓抗菌肽能显著提高贵州黄鸡日均增重，降低料重比，降低发病率和死亡率。贾久满等[20]通过蚯蚓自身的体内酶水解制取蚯蚓浸出液，结果表明蚯蚓水解液与浸出液对大肠杆菌的抑菌效果相近，蚯蚓水解液中含有一定量的抗菌肽类物质并具有较好的抗菌活性。

4展望

抗生素作为饲料添加剂的使用已引起了争议，在抗生素逐步被禁用而新代用品尚未出现的情况下，研究开发蚯蚓抗菌肽代替抗生素作新型饲料添加剂将具有巨大的经济效益和深远意义。

参考文献

[1] 李冠楠，夏雪娟，隆耀航，等.抗菌肽的研究进展及其应用[J].动物营养学报,2014，26(1):17-25.

[2] 文加才，秦永忠.阳离子抗菌肽的研究进展[J].国外医药:抗生素分册,2002，23(6):267-271.

[3] ZASLOFF M,MARTIN B,CHEN H C.Antimicrobial activity of synthetic magainin peptides and several analogues[J].Proceedings of the national academy of sciences,1988,85(3):910-913.

[4] DHAINAUT A,RAVEILLON B,M'BÉRI M,et al.Purification of an antibacterial protein in the coelomic fluid of Nereis diversicolor (annelida,polychaeta).Similitude with a cadmium-binding protein[J].Comparative biochemistry and physiology part C:Comparative pharmacology,1989,94(2):555-560.

[5] VALEMBOIS P,ROCH P,LASSEGUES M,et al.Antibacterial activity of the hemolytic system from the earthwormEiseniafetidaandrei[J].Journal of invertebrate pathology,1982,40(1):21-27.

[6] 张阳，王艳红，张华，等.一种蚯蚓体腔液蛋白的分离纯化及其生物活性[J].天然产物研究与开发,2011,23(1):89-93.

[7] CHO J H,PARK C B,YOON Y G,et al.Lumbricin I,a novel proline-rich antimicrobial peptide from the earthworm:Purification,cDNA cloning and molecular characterization[J].Biochimica et biophysica acta (BBA)-Molecular basis of disease,1998,1408(1):67-76.

[8] 赵晓瑜，李国建，倪志华，等.人工合成蚯蚓29肽的特性[J].河北大学学报(自然科学版),2009，29(1):76-80.

[9] 李国建.蚯蚓29肽抗菌活性分析以及基因在大肠杆菌中的表达[D].保定：河北大学，2009.

[10] 柳伟强.蚯蚓抗菌肽40 kDa Fetidin 基因的克隆与表达[D].保定：河北大学,2006.

[11] 刘艳琴，孙振钧，张国中，等.蚯蚓寡肽对伪狂犬病毒感染细胞和HeLa细胞凋亡的影响[J].畜牧兽医学报,2006，36(9):942-946.

[12] 王庄，李曾夏子，李文平，等.蚯蚓中3~30 kD抗菌肽的分离及抗菌效果研究[J].湖南农业大学学报(自然科学版),2010(S1):50-53.

[13] 王庆华，胥清芳，龙李，等.两种蚯蚓提取物对大肠杆菌的抑菌效果[J].黑龙江畜牧兽医,2011(2):131-132.

[14] 郑津辉,孟庆恒,王景安，等.蚯蚓抗菌肽的提取与抗菌活性研究[J].食品研究与开发,2008，29(10):51-53.

[15] 贾久满,朱莲英,石洪凌，等.蚯蚓水解液对大肠杆菌的抑菌效果[J].安徽农业科学,2007，35(4):969.

[16] 赵琴，李曾夏子，李文平，等.3~30 ku 蚯蚓抗菌肽对兔巴氏杆菌病治疗效果研究[J].现代农业科技,2010(18):299-301.

[17] 李曾夏子.3~30 kD 蚯蚓抗菌肽的分离纯化及其抗菌效果的研究[D].长沙：湖南农业大学， 2010.

[18] 吴海,鲁延义.蚯蚓抗菌肽对贵州黄鸡采食量及料肉比的影响[J].畜牧兽医科技信息,2009(10):90.

[19] 李冬光,施晓丽.蚯蚓抗菌肽对贵州黄鸡生产性能的影响研究[J].饲料工业,2011，32(12):45-47.

[20] 贾久满,郑素玲,李成会，等.蚯蚓水解液与浸出液对大肠杆菌的抑菌效果[J].饲料研究,2007(10):3-4.

收稿日期2016-01-04

作者简介李娟(1984- )，女，湖北荆门人，畜牧师，博士，从事动物遗传育种及生物技术研究。

基金项目成都市科技惠民技术研发项目(2015-HM01-00351-SF)。

中图分类号S 899.8

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)03-062-02