南重楼中4种重楼皂苷超声提取工艺

刘 江，段志刚，段宝忠，夏从龙　(大理大学药学与化学学院，云南大理 671000)



南重楼中4种重楼皂苷超声提取工艺

刘 江，段志刚，段宝忠，夏从龙*(大理大学药学与化学学院，云南大理 671000)

摘要[目的]优化南重楼中4种重楼皂苷提取的最佳工艺。[方法]采用L9(34)正交试验，对提取溶剂的单次料液比、单次提取时间、初始提取温度、提取次数4因素进行优化考察，HPLC法测定4种重楼皂苷含量并作为考察指标。[结果]最佳提取工艺单次料液比为15倍的甲醇，每次提取20 min，初始提取温度为40 ℃，提取次数为3次。[结论]该提取工艺操作简单、合理、可行、重复性好、稳定可靠，可用于南重楼中4种重楼皂苷的提取。

关键词南重楼；重楼皂苷；HPLC法；提取工艺；正交试验

南重楼Parisvietnamensis(Takht.)H.Li 为百合科重楼属植物，主要分布于贵州，广西西南部、西部，以及云南的东南部、南部和西部，越南北部也有少量分布[1-2]，其以根茎入药，具有清热解毒、散瘀消肿、祛痰、平喘和止血的功能[3]。查阅相关文献表明，重楼皂苷提取方法有超声提取法、微波提取法、酶解法、浸渍法和回流提取法等[4-6]，不同的方法具有各自的优点，超声提取具有方便、能明显缩短提取时间、降低提取温度等优点，因此在重楼提取工艺中应用较多。基于超声提取的这些优点，该试验采用正交试验对提取溶剂的单次料液比、单次提取时间、初始提取温度、提取次数4因素进行优化考察，HPLC法测定4种重楼皂苷含量并作为考察指标，对南重楼中4种重楼皂苷超声提取工艺进行优选，以获取最佳提取工艺。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1仪器。Agilent 1290高效液相色谱仪(G4204A Quat Pump，G4226A Sampler，G1316C TCC，G4212B DAD)；EL204十万分之一电子天秤[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；SB25-120型超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；艾柯DZG-303A超纯水机[(台湾艾柯)成都康宁实验专用纯水设备厂]。

1.1.2试药。重楼皂苷I、II、VI、VII对照品(贵州迪大生物科技有限责任公司，批号分别为GZDD-0605、GZDD-0606、GZDD-0608、GZDD-0609，纯度均达98%以上)，流动相所用乙腈、甲醇均为HPLC级色谱纯。其余试剂为分析纯，水为超纯水。

1.1.3试材。样品于2014年9月18日采自云南省文山壮族苗族自治州，经大理大学药学与化学学院生药教研室夏从龙教授鉴定为南重楼(Parisvietnamensis)。

1.2方法

1.2.1正交试验。选取甲醇单次料液比(A)、单次提取时间(B)、初始提取温度(C)、提取次数(D)为考察因素，以4种重楼皂苷含量为指标，采用L9(34)正交表(表1)安排试验。

1.2.2对照品溶液的制备。准确称取重楼皂苷I、II、VI、VII这4种对照品，溶于甲醇配制成质量浓度分别为0.64、0.46、0.26、0.23 mg/mL的对照品溶液，按1∶1∶1∶1混合，过滤，备用。

1.2.3正交试验供试品溶液的制备。根据L9(34)正交设计因素水平表，精密称定南重楼粉末(过40目筛)采用对应提取方式，得到不同提取条件下的提取溶液，过滤，备用。

1.2.4方法学考察。

1.2.4.1色谱条件及系统适用性。根据药典方法[7]进行适当的调整，色谱柱为AgilentC-18柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)，检测波长为203 nm，柱温25 ℃；流动相乙腈(A)—水(B)梯度洗脱(0～14 min，30%～40%A；14～40 min，40%A；40～70 min，40%～60%A)，流速为0.9 mL/min，进样量5 μL。

1.2.4.2标准曲线的绘制。分别精密吸取混合对照品溶液1、2、5、10、15、20 μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图，测定峰面积。以进样量X(μg)为横坐标、峰面积Y为纵坐标进行线性回归。

1.2.4.3精密度试验。精密吸取对照品溶液连续进样5次，测定重楼皂苷I、II、VI、VII的峰面积，计算RSD值。

1.2.4.4稳定性考察。取供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12、24 h进样测定峰面积，计算重楼皂苷I、II、VI、VII峰面积的RSD值。

1.2.4.5重复性试验。取样品5份，按最优工艺制备供试品溶液，测定重楼皂苷I、II、VI、VII的含量并计算其RSD。

1.2.4.6加样回收率试验。精密称定样品5份，加入各对照品适量，按选定的最优工艺制备供试品溶液。按“1.2.4.1”色谱条件测定重楼皂苷I、II、VI、VII的含量并计算其RSD。

1.2.5样品含量测定。吸取供试品溶液和混合对照品溶液，按“1.2.4.1”色谱条件测定各色谱峰的峰面积，利用标准曲线法计算含量。

1.2.6验证试验。精密称定样品5份，以选定最优工艺提取，按“1.2.4.1 ”色谱条件测定重楼皂苷I、II、VI、VII的含量以考察最优工艺的稳定性。

2结果与分析

2.1方法学考察

2.1.1系统适用性。图1表明，在“1.2.4.1”条件下，样品所测主峰旁无明显杂质峰，经计算样品峰与其他峰的分离度>1.5，理论塔板数按重楼皂苷I、II、VI、VII计算均不低于10 000，符合含量测定要求。

2.1.2标准曲线的绘制。按“1.2.4.2”测定，以进样量X(μg)为横坐标、峰面积Y为纵坐标得出重楼皂苷I、II、VI、VII的线性回归方程分别为YI=366.44XI+3.07(r=0.999 9)、YII=377.60XII+2.42(r=0.999 9)、YVI=340.35XVI+1.63(r=0.999 9)、YVII=344.22XVII+0.37(r=0.999 9)，表明重楼皂苷I、II、VI、VII分别在0.64～12.80、0.46～9.20、0.26～5.20、0.23～4.60 μg范围内线性关系良好。

2.1.3精密度试验。连续进样5次，重楼皂苷I、II、VI、VII峰面积的RSD分别为2.34%、2.06%、2.17%、2.10%，表明该方法精密度良好。

2.1.4稳定性考察。按“1.2.4.4”操作，重楼皂苷I、II、VI、VII峰面积的RSD分别为2.02%、2.71%、2.72%、2.98%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.1.5重复性试验。平行样5份，测定重楼皂苷I、II、VI、VII的含量，其含量的RSD分别为0.54%、2.15%、1.91%、2.78%，表明方法重复性良好。

2.1.6加样回收率试验。按“1.2.4.6”操作，测定重楼皂苷I、II、VI、VII的平均回收率分别为101.04%、101.73%、98.69%、101.17%，RSD分别为1.33%、2.34%、1.64%、2.17%。

2.2样品含量测定按L9(34)正交表进行试验，结果表明(表2)，南重楼中重楼皂苷的最佳提取工艺为A3B2C2D3组合，即15倍的溶媒，每次提取20 min，初始提取温度为40 ℃，提取3次，极差R顺序为D>C>A>B，即所考察因素中提取次数对重楼皂苷的提取率影响最大，其次为初始提取温度、甲醇单次料液比、单次提取时间。

2.3验证试验由表3可知，通过选定的最优工艺提取的样品，其总含量的平均值为13.349 mg/g，RSD=0.84%，表明该工艺达到了优化目的且稳定性良好。

3讨论与结论

近年来已有很多研究通过正交试验来优化重楼皂苷的提取工艺[8-12]，卢伟等[9]采用正交试验优选出重楼甾体皂苷最佳提取工艺为90%的乙醇溶液加热回流提取，料液比为1∶12，提取3次，每次1 h；冯旋等[11]采用正交试验优选出提取重楼甾体皂苷的最佳工艺为4倍于生药量的70%乙醇回流提取3次，每次2 h；郭莉萍等[13]基于均匀设计优化出重楼皂苷提取的最佳工艺为加热回流时间20 min、浸泡时间29.02 h、提取液乙醇浓度39.68%、加热回流次数8次，但各提取工艺不尽相同，且总皂苷的含量也各不相同。而该试验综合以上试验全面地考察了南重楼中4种重楼皂苷的提取工艺，试验采用HPLC法测定4种重楼皂苷含量并作为考察指标，以L9(34)正交试验考察了超声提取4种重楼皂苷中不同因素对提取率的影响，结果表明，对重楼皂苷提取率影响最大的因素为提取次数，其次为初始提取温度和甲醇单次料液比，影响最小的为单次提取时间；得出最佳工艺为甲醇单次料液比1∶15、每次提取20 min、初始提取温度为40 ℃、提取3次，最优工艺验证试验结果表明该方法可行、重复性好、稳定可靠，可用于南重楼中4种重楼皂苷的提取，通过该试验进一步优化南重楼中4种重楼皂苷的提取工艺，为南重楼中4种重楼皂苷的提取提供理论依据。

参考文献

[1] 中国科学院中国植物志编委员会.中国植物志：第15卷[M].北京：科学出版社，1978：86.

[2] 中国科学院昆明植物研究所.云南植物志：第8卷(下)[M].北京：科学出版社，2006：664.

[3] 黄芸，崔力剑，王强，等.南重楼Parisvietnamensis活性物质的分离与鉴定[J].药学学报，2006，41(4)：361-364.

[4] 兰洁，杨明，马家骅.重楼提取工艺的研究[J].中草药，2006，37(6)：871-872.

[5] 冯旋，黄文通，陈军.重楼皂苷提取工艺的研究[J].广东药学，2005，15(6)：19.

[6] 叶方，杨光义，李志荣，等.重楼皂苷的提取工艺及质量控制研究概述[J].中国药师，2011，14(8)：1207-1209.

[7] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2015：260.

[8] 李维莉，彭永芳，李银，等.超声法提取重楼中重楼皂苷的研究[J].中成药，2010，32(2)：218-220.

[9] 卢伟，杨光义，叶方，等.正交试验设计优选重楼总皂苷提取工艺[J].中国药师，2015，18(9)：1484-1487.

[10] 兰洁，杨明，马家骅.重楼提取工艺的研究[J].中草药，2006，37(6)：871-872.

[11] 冯旋，黄文通，陈军.重楼皂苷提取工艺的研究[J].广东药学，2005，15(6)：19.

[12] 孙治国，张琳，李凌军，等.重楼总皂苷提取工艺研究[J].中药材，2007，30(6)：726-729.

[13] 郭莉萍，陈雨，邹卉瑜，等.基于均匀设计优化重楼皂苷提取工艺[J].常熟理工学院学报，2008，22(8)：65-69，94.

Ultrasonic Extraction Technology of Four Kinds of Polyphyllin inParisvietnamensis

LIU Jiang, DUAN Zhi-gang, DUAN Bao-zhong, XIA Cong-long*

(College of Pharmacy and Chemistry, Dali University, Dali, Yunnan 671000)

Key wordsParisvietnamensis; Polyphyllin; HPLC method; Extraction technology; Orthogonal design

Abstract[Objective] To select the optimal extraction procedure of polyphyllin from four kinds ofParisvietnamensis. [Method] L9(34) orthogonal test was adopted to investigate the four factors of solid-liquid ratio, extraction time, initial extraction temperature and extraction times. Polyphyllin contents in four kinds ofP.vietnamensiswere detected by HPLC method. [Result] The optimal extraction condition was as follows: 15 times of methanol, 20 min extraction time, 40 ℃ extraction temperature, and three extraction times. [Conclusion] This extraction technology is simple, stable, reliable, reasonable and feasible, and can be used for the extraction of polyphyllin from four kinds ofP.vietnamensis.

基金项目云南省科技厅面上项目(2013FB059)。

作者简介刘江(1991- )，男，云南曲靖人，硕士研究生，研究方向：药用植物的药效学。*通讯作者，教授，硕士，硕士生导师，从事天然药物资源调查与品质评价研究。

收稿日期2016-01-22

中图分类号S 567.23+9

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)07-158-03