利用腹腔内窥镜方法比较不同输精时间对羊体内胚胎生产效率的影响

艾合麦提·吐尔逊，杨明辉，宋玉坤，徐志远，姬鹏云，贾功雪，张金龙，张效生，朱士恩，刘国世*

(1.中国农业大学 动物科技学院，北京 100193； 2.新疆阿克苏地区畜禽改良站 843001；

3.天津市畜牧兽医研究所，天津 300381)



利用腹腔内窥镜方法比较不同输精时间对羊体内胚胎生产效率的影响

艾合麦提·吐尔逊1，2，杨明辉1，宋玉坤1，徐志远1，姬鹏云1，贾功雪1，张金龙3，张效生3，朱士恩1，刘国世1*

(1.中国农业大学 动物科技学院，北京 100193； 2.新疆阿克苏地区畜禽改良站 843001；

3.天津市畜牧兽医研究所，天津 300381)

摘要：为提高供体绵羊胚胎生产效率，实验选取99只供体母羊，用FSH+CIDR法诱导发情超排。将正常发情的供体母羊随机分成两组进行输精，分别在超排撤栓后的第48 h和54 h利用腹腔内窥镜法输精。其中48 h输精组供体母羊51只，54 h输精组供体母羊48只。其结果显示：撤栓后54 h输精胚胎回收率极显著高于48 h输精组(P<0.01)；54 h输精组供体卵母细胞受精率(97.27%)极显著高于48 h输精组(87.02%)(P<0.01)；54 h组供体平均可用胚数显著高于48 h组(P<0.05)；撤栓后54 h利用腹腔内窥镜输精组可用胚比率(89.70%)显著高于48 h组(80.53%)(P<0.05)；移植后受体妊娠率，54 h组(70.44%)极显著高于48 h组(56.92%)。本研究结果显示，利用本实验超排方案，供体撤栓后54 h利用内窥镜一次定时输精相对于48 h输精显著提高了供体胚胎生产效率，对羊体内胚胎生产提供理论和技术支持。

关键词：羊；腹腔内窥镜；输精时间；超数排卵；胚胎移植

资助项目：国家转基因育种重大专项(2014ZX08008-002B、2014ZX08008-005)

E-mail:gshliu@cau.edu.cn

胚胎移植指的是“借普通家畜之腹怀优秀个体之胎”，从而提高良种后代的生产效率，缩短杂交改良过程，而使种用性能差的雌性个体直接生产出良种后代，以迅速提高个体生产性能和整个畜群的畜产品品质，从而带来巨大的经济效益[1，2]。对于羊超数排卵供体的输精目前主要有传统开膣器输精和内窥镜法输精两种。传统的阴道开膣器子宫颈输精技术操作简单、成本低，但精液需要量大、受胎率低。而近年来逐渐推广的内窥镜输精技术输精次数少、受胎率高[3]。1987年，我国首次应用腹腔镜子宫深部输精法，该技术通过腹腔镜将种公羊精液直接输送到排卵一侧的子宫角受精部位。内窥镜输精技术操作相对比较复杂，但其比常规子宫颈输精技术受胎率有大幅的提高，能最大限度地发挥优良公畜的利用率[4]。由于绵羊子宫颈特殊的解剖学关系，与牛的人工授精技术相比，绵羊人工授精的效率始终不高。 通过腹腔内窥镜输精，子宫颈障碍可以被有效的规避[5]。人工输精不同于自然配种，要人为地掌握好输精的时间以使卵子得到更充分的成熟和保持精子最大的活率来完成受精过程。因此，输精时间是制约内窥镜输精效率的重要因素[6]。目前，国内外关于不同输精时间对内窥镜输精供体体外胚胎生产效率影响的报道并不多见，本实验针对内窥镜子宫深部输精方法，探讨48 h和54 h两个不同输精时间对供体胚胎生产效率的影响，以期优化输精方法，提高胚胎移植效率，并使之能够在生产中得到广泛的推广和应用。

1材料与方法

1.1试验用羊

于2014年11月～2015年5月选用遵化市雅华牧业有限公司的体重在60～80 kg，体况良好、无繁殖疾病经产黑头萨福克母羊做供体；受体杂交小尾寒羊为1～4岁，体重在50 kg以上，膘情良好、无繁殖疾病。试验前期补饲，确保体况中等以上；采精公羊为养殖场纯种黑萨福克公羊，性欲良好，精液质量检测优良。试情公羊为性欲旺盛的成年黑头萨福克公羊。

1.2药品与试剂

促黄体素(LH)、孕马血清促性腺激素(PMSG)、促卵泡素(FSH)购自宁波三生药业有限公司；氯前列烯醇(PG)购自上海计划生育研究所；阴道栓(CIDR)购自新西兰产EAZI-BREED-CIDR，20个/袋； Holding培养液为新西兰生产，50 mL/袋；酒精、碘酒、新洁尔灭、抗生素、生理盐水、青霉素、链霉素等为国产。

1.3供体羊超排处理方案

供体羊在发情周期内任意一天阴道内植入阴道栓(含0.3 g孕酮)，将其定为第0天，在第12天时按4 d 8针的方法连续肌肉注射促卵泡素(FSH)，按早晚剂量相等，每天剂量递减的方法，平均每天递减5 IU进行超排处理，并于第13天撤栓。撤栓24 h后每天3次用试情公羊试情。分别在撤栓后48 h和54 h进行腹腔内窥镜一次输精。

1.4试验分组

本试验分不同输精时间，即48 h和54 h对供体绵羊超排效果的影响进行比较试验。此因素的试验都是在其他因素基本一致的条件下进行。

1.5配种输精方式

本实验采用腹腔内窥镜方法进行输精。人工采集种公羊精液，镜检，活力达0.6以上方可用于人工输精。

1.6胚胎质量鉴定

输精后第5～6天手术法从子宫角冲胚，采集的胚胎用事先在培养箱预热的平皿接收，写好编号。在实体显微镜下分检可用的胚胎放入在 35℃恒温板上有胚胎保持液的平皿中，盖好平皿盖后待处理。根据胚胎的轮廓、细胞密度、分裂球的大小和数量、细胞的色泽等将胚胎分为 A、B、C 和 D 4个等级。其中 A、B、C 级胚胎可用于鲜胚的移植，但C级只能与A级或B级胚胎一起移植，D 级不可使用。

1.7受体处理与腹腔内窥镜法胚胎移植

使用CIDR+PMSG法，与供体羊同步埋植CIDR，在供体羊撤栓前半天撤除CIDR，注射280 IU PMSG，12 h 后每天3次用试情公羊试情，详细记录发情时间。采用腹部微创手术法处理受体羊，腹腔内窥镜观察，单侧卵巢1～3个黄体则移植1～2枚桑葚胚或囊胚。左右创口结晶磺胺处理后各缝1针后，注射黄体酮和抗生素。

1.8供受体羊术后处理

羊术后在单独的圈内观察1～2 d，圈舍应勤加打扫，保持清洁干燥以防感染，如有异常应尽快进行治疗处理，保证术后恢复良好。

1.9统计分析

使用SPSSv19.0对超排供体胚胎回收率、卵母细胞受精率、可用胚比率进行Z检验；平均可用胚胎数选择单尾t检验方法，结果以平均值±标准误表示。

2结果与分析

2.1撤栓后不同输精时间对供体胚胎回收率的影响

将供体撤栓后48 h和54 h两种不同的输精时间对供体进行输精后5～6 d的供体胚胎回收率进行统计分析(见表1)。结果显示，撤栓后54 h进行输精的供体胚胎回收率78.95%(330/418)极显著高于撤栓后48 h输精组供体胚胎回收率59.68%(262/439)(P<0.01)。

表1不同输精时间对供体胚胎回收率的影响

输精时间供体/只黄体总数/个冲胚总数/枚胚胎回收率/%撤栓后54h4841833078.95(330/418)A撤栓后48h5143926259.68(262/439)B

注：同列数据肩标不同大写字母者表示差异极显著(P<0.01)

2.2撤栓后不同输精时间对供体胚胎受精率的影响

将供体撤栓后48 h和54 h两种不同的输精时间进行输精后5～6 d的供体胚胎受精率进行统计分析(见表2)。结果显示，撤栓后54 h进行输精后供体回收卵子的受精率97.27%(321/330)极显著高于撤栓后48 h输精组供体受精率87.02%(228/262)(P<0.01)。

表2不同输精时间对供体受精率的影响

输精时间供体/只未受精卵/枚冲胚总数/枚受精率/%54h48933097.27(321/330)A48h513426287.02(228/262)B

注：同列数据肩标不同大写字母者表示差异显著(P<0.01)

2.3撤栓后不同输精时间对供体平均可用胚数的影响

将供体撤栓后48 h和54 h两种不同的输精时间输精后5～6 d的供体平均可用胚进行统计分析(见表3)。结果显示，撤栓后54 h进行输精后供体回收的平均可用胚数(6.30枚/只)显著高于撤栓后48 h输精组供体平均可用胚数(4.43枚/只)(P<0.05)。

表3不同输精时间对供体平均可用胚数的影响

输精时间供体/只冲胚总数/枚平均可用胚数/枚撤栓后54h483306.30±0.71a撤栓后48h512624.43±0.70b

注：同列数据肩标不同小写字母者表示差异显著(P<0.05)

2.4撤栓后不同输精时间对供体可用胚率的影响

将供体撤栓后48 h和54 h两种不同的输精时间后5～6 d的供体可用胚率进行统计分析(见表4)。结果显示，撤栓后54 h进行输精供体回收的胚胎可用胚率89.70%(321/330)显著高于撤栓后48 h输精组供体胚胎可用胚率80.53%(211/262)(P<0.05)。

表4不同输精时间对供体可用胚率的影响

输精时间供体/只冲胚总数/枚可用胚/枚可用胚率/%54h4833029689.70(296/330)A48h5126221180.53(211/262)B

注：同列数据肩标不同小写字母者表示差异显著(P<0.05)

2.5撤栓后不同输精时间对胚胎移植妊娠率的影响

将供体撤栓后48 h和54 h两种不同的输精时间进行供体输精后5～6 d的供体可用胚进行移植的妊娠率进行统计分析(见表5)。结果显示，撤栓后54 h进行输精供体回收胚胎移植后的妊娠率70.44%(143/203)极显著高于撤栓后48 h输精组的胚胎移植妊娠率56.92%(111/195)(P<0.01)。

表5不同输精时间对胚胎移植妊娠率的影响

输精时间移植总数/只移植受体妊娠数/只移植妊娠率/%撤栓后54h20314370.44(143/203)A撤栓后48h19511156.92(111/195)B

注：同列数据肩标不同大写字母者表示差异极显著(P<0.01)

3讨论

利用CIDR栓同期发情技术，使被处理的母羊发情同步化，集中输精，集中产羔，便于集约化进行饲养管理[7]。Maxwell等[8]认为，阴道栓取出后48～60 h内输精较为合适，过早(24～36 h)和过迟(72～78 h)输精的受精率均较低。本试验对同期发情母羊采用撤栓后48 h和54 h进行子宫内输精的结果进行了统计比较，证实采用本试验的同期发情方案、发情母羊在撤栓后54 h输精时供体胚胎生产效率最高。

本试验研究表明，54 h输精胚胎回收率显著高于48 h输精组，主要是由于输精时间较晚，排卵比较充分，因此避免了在输精操作时牵引子宫角带动输卵管伞部移动而导致卵母细胞的丢失，使得收集到的卵母细胞较多，几乎不存在卵母细胞丢失现象。这也是能够得到更多的平均可用胚的主要原因。因而54 h后受精得到的胚胎回收率较高。

输精时间晚，卵母细胞完全排出并充分成熟，缩短了精子在输卵管中等待受精的时间，有利于精子活力的保持[9]。杨梅等[10～12]通过观察山羊和绵羊超数排卵处理时间对卵母细胞成熟的影响研究发现，在撤栓后母羊发情时注射LH后的37～39 h卵母细胞成熟率较高，即卵母细胞在此时间段内集中成熟。本实验于撤栓后54 h输精，与卵母细胞集中成熟的时间同步，48 h输精效果差的原因可能是

卵母细胞尚未成熟完全，长时间的等待让精子的受精能力急剧下降，最终导致受精结果不理想。即使能够成功受精，也势必会影响后续受精卵的分裂及发育，这样的胚胎从供体子宫中回收后移植到受体子宫角内，其适应性也远比不上质量好的胚胎，因此最后得到的受体妊娠率会比较高。总体来讲，54 h输精组卵母细胞回收率高，卵母细胞质量好且成熟完全，致使输精后得到的平均可用胚数、受精率和可用胚率显著高于48 h组。

综上所述，采用本试验的同期发情方案，供体母羊在撤栓后54 h一次定时输精较48 h输精组供体胚胎生产效率高。

4参考文献

[1]张璐，朱士恩，李树静，等.5 个品种优质肉用绵羊的超数排卵与胚胎移植[J].中国畜牧杂志，2012，47(23)：25-28

[2]李焕玲，王金文，王德芹，等.不同输精方法和输精次数对绵羊冷冻精液受精率的影响[J].当代畜牧，2006，(04)：26-02

[3]柴孟龙，刘国世，汪锋，等.肉用黑萨福克绵羊超数排卵和配种授精方案的优化[J].中国畜牧杂志，2013，(07)：34-04

[4]张朝玉，吴晓晓，何宗霖，等.萨福克羊内窥镜输精试验[J].新疆畜牧业，2015，(03)：32-02

[5]陈宝才.绵羊的高效繁殖技术[J]，中国草食动物.2014，(10)：35

[6]张航，宋玉坤，秦文向，等.影响山羊体内原核胚生产的因素研究[J].中国畜牧杂志，2014，(09)：28-04

[7]王玉琴.肉用绵羊规模化胚胎移植生产技术体系的研究与应用[D].甘肃农业大学，2005

[8]Maxwell W M C.Artificial insemination of ewes with frozen thawed semen at a synchronized oestrus.Effect of time of onset of oestrus，ovulation and insemination on fertility.Anim Reprod.Sci .1986，(07)：41

[9]Motlomelo K C，Greyling JPC，Schwalbach LMJ.Synchronization of oestrus in goats：the use of different progestagen treatments.Small Ruminant Research .2002

[10]杨梅，王旭光.山羊用CIDR +FSH超数排卵处理的效果与卵母细胞成熟情况观察[J].草食家畜，2003，(03)：29-30

[11]毕江华，袁天杰，李树静.绵羊重复超数排卵技术的研究[C].中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十五届学术研讨会论文集 (下册)，2010.

[12]易金云，李继成，刘国世，等.黑萨福克和杜泊绵羊超数排卵效率比较及分析[J].草食家畜，2015，(03)：29-07

通讯作者：刘国世，男，教授，博士生导师。

作者简介：艾合麦提·吐尔逊，男，高级畜牧师。

收稿日期：2016-01-04

中图分类号：S826.3

文献标识码：A

文章编号：1005-2739(2016)02-0006-04