高良姜多糖对酪氨酸酶抑制作用的研究

杨达城， 何曾华， 屈 义， 袁小谊， 刘 海， 谌素华， 钟赛意*

(1.广东海洋大学食品科技学院，广东湛江 524088；2.广东海洋大学实验教学部现代生化中心，广东湛江 524088)



高良姜多糖对酪氨酸酶抑制作用的研究

杨达城1， 何曾华1， 屈 义1， 袁小谊1， 刘 海2， 谌素华1， 钟赛意1*

(1.广东海洋大学食品科技学院，广东湛江 524088；2.广东海洋大学实验教学部现代生化中心，广东湛江 524088)

摘要[目的]研究高良姜多糖对酪氨酸酶活性的抑制作用。[方法]以新鲜的高良姜和马铃薯为原料，通过比色法、色差仪法、Photoshop图像灰度值分析等测定高良姜多糖对马铃薯酪氨酸酶活性的抑制率，以及对马铃薯匀浆褐变度和反应体系颜色值变化的影响。[结果]试验得出，高良姜多糖对酪氨酸酶的活力有显著的抑制作用，其IC50为0.315 mg/mL，能显著降低反应体系的褐变度。[结论] 高良姜多糖具有较强的酪氨酸酶抑制活性，可望用于美白护肤、果汁护色、鲜切果蔬保鲜等领域,值得进一步研究。

关键词高良姜多糖；酪氨酸酶；抑制作用；褐变

Inhibitory Effect of Polysaccharides fromAlpiniaofficinarumHance on Tyrosinase Activity

YANG Da-cheng，HE Zeng-hua，QU Yi，ZHONG Sai-yi*et al (College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang，Guangdong 524088)

Abstract[Objective]To investigate the effect of polysaccharides fromAlpiniaofficinarumHance on the inhibition of tyrosinase activity.[Method] With freshA.officinarumand potato as raw materials，colorimetry，color-difference meter and image gray value analysis with Photoshop were employed to investigate the effect of polysaccharides on the inhibition of tyrosinase activity in potato，browning of potato homogenates，and color values changes of the reaction system.[Result] The results showed that polysaccharides could significantly inhibit the tyrosinase activity，with anIC50of 0.315 mg/mL，and reduce the browning degree of reaction system.[Conclusion] The polysaccharide fromA.officinarumhas strong inhibitory effect on tyrosinase activity，which is expected to be used in whitening skin，juice color protection，fresh cut fruits，vegetables preservation areas，and is worth further studying.

Key wordsAlpiniaofficinarumHance polysaccharide; Tyrosinase; Inhibitory effect; Browning

酪氨酸酶(EC 1.14.18.1)是一种活性中心具有双铜离子的氧化还原酶，广泛存在于微生物、动物和植物中，参与黑色素合成的前两步反应，是黑色素合成的限速酶，由酪氨酸酶催化酪氨酸氧化形成黑色素的反应是引起皮肤色素沉积、蔬菜水果褐变的关键酶[1]。因此，酪氨酸酶抑制剂被作为具有美白作用的添加剂加入到化妆品中或者用于食品保鲜。近几年来，从天然产物中寻找酪氨酸酶抑制剂引起越来越多国内外学者的关注[2-4]，寻找一种有效的来自天然产物的酪氨酸酶抑制剂在食品工业方面具有实际的应用价值。

高良姜，又名徐闻良姜，药学名AlpiniaofficinarumHance，是一种热带、亚热带多年生长的姜科植物，具有较高的药用和食用价值，是十大南药之一。前人研究显示，高良姜化学成分复杂，药理活性强，有较强的抗溃疡、抗腹泻、利胆、镇痛、抗炎、抗血栓形成等作用，是一种尚未充分开发利用的保健和药用资源，具有较高的学术研究价值和实际开发利用价值。湛江徐闻县是高良姜的原产地，是我国高良姜的最主要生产基地。然而，由于目前高良姜的用途单一，基本仅以干品作为药材使用，销量有限。近年来，由于收购价格不稳定，高良姜的种植面积逐步萎缩，这一宝贵的南药资源没有得到应有的开发和利用。

高良姜多糖在抑制酪氨酸酶作用方面研究较少，且用于抑制马铃薯褐变的研究尚未见报道。笔者以清水处理为对照，探究随着时间变化，不同含量高良姜多糖对马铃薯样品色泽的影响及其相关生理变化。拟以0.6 mg/mL抗坏血酸为阳性对照，对比高良姜多糖与抗坏血酸对马铃薯褐变抑制作用的差异，旨在为高良姜多糖在抑制酪氨酸酶方面的应用提供理论依据，为高良姜多糖的进一步研究开发与利用以及新型高效酪氨酸酶抑制剂的开发提供参考。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1原料及主要试剂。供试原料：新鲜高良姜，采自湛江徐闻县龙塘镇高良姜基地；新鲜马铃薯，购于湛江湖光市场。主要试剂：抗坏血酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、邻苯二酚，分析纯，广东光华科技股份有限公司; 聚乙烯吡咯烷酮(K30)，分析纯，上海展云化工有限公司。

1.1.2主要仪器设备。DC-P3自动色差仪，北京市兴光测色仪器有限公司；UV-2800AH型紫外可见光分光光度计，尤尼柯(上海)仪器有限公司；KDC-160HR高速冷冻离心机，科大创新股份有限公司中佳分公司；NP 200A型电子太平，上海精科天平；YKKY雪花制冰机，北京长流科学仪器公司。

1.2方法

1.2.1高良姜多糖的制备。新鲜高良姜茎块清洗干净后，在40 ℃烘箱中干燥至恒重，粉碎，称取200 g高良姜粉，加入4倍量体积95%乙醇，回流提取3 h，离心得提取液，其残渣再用相同体积和浓度的乙醇重复提取一次，合并提取液，经4 000 r/min 离心 15 min后收集沉淀，依次用无水乙醇、丙酮、石油醚进行多次抽洗。残渣风干后以料液比1∶20 g/mL、80 ℃热水浸提2 h，取上清液浓缩，加 95%乙醇醇析，沉淀物用蒸馏水复溶后再加95%乙醇醇析，反复3次，将沉淀依次用无水乙醇、无水乙醚、丙酮洗涤，得高良姜粗多糖。继续采用Sevage法除蛋白。用少量双蒸水溶解粗多糖，混匀后按4∶1的比例加入氯仿-正丁醇(5∶1) 混合液，振摇20 min，离心去除蛋白，重复2~3 次。上清液用3倍体积的乙醇沉淀，即得脱蛋白的高良姜多糖。将多糖溶解后加入适量的30%H2O2，在50 ℃下保温脱色20 min，加入 3倍体积的相应浓度的乙醇，离心后取沉淀用 95%乙醇、无水乙醇各淋洗 1 次，丙酮、乙醚各淋洗 2 次后，真空干燥得高良姜水溶性多糖。

1.2.2酪氨酸酶的提取。参照文献[5-7]的方法，略做修改。取10 g马铃薯肉，向研钵加入30 mL pH 6.8的0.2 mol/L磷酸缓冲液(内含0.4 gPVP和0.1%triton X-100),研磨，分2次各加10 mL磷酸缓冲液洗研钵并转移至离心管，冰浴10 min，在4 ℃，8 000 r/min条件下离心15 min，上清液备用，即为酪氨酸酶粗酶液。

1.2.3褐变度的测定。参照文献[8-11]的方法，略做修改。将马铃薯肉匀浆，按照2∶3(m/V)的比例分别与浓度为0.2、0.6、1.0 mg/mL的高良姜多糖于试管中混匀，在40 ℃恒温水浴120 min后，在25 ℃、8 000 r/min的条件下离心15 min，将上清液倒入试管，拍照，然后用分光光度计在410 nm波长下测定各个上清液的吸光值，以吸光值大小表示褐变度。以蒸馏水为对照组，以0.6 mg/mL的抗坏血酸作为阳性对照。

1.2.4高良姜多糖对酪氨酸酶的抑制作用。参考文献[12]的方法并略做修改。灰度值是指物体表面颜色的深度，它能反映色素的含量。灰度值愈小，染色愈深，黑色素的含量愈多，灰度值与黑色素的含量呈反比，即灰度值越小，说明褐变程度越大。在培养皿中加入10 mL粗酶液，同时迅速加入底物邻苯二酚2 mL和1 mL浓度分别为0.6、0.8和1.0 mg/mL的高良姜多糖，以0.6 mg/mL抗坏血酸作阳性对照，用Photoshop图像处理软件测定其灰度值，以划“X”的方式取5个点，计算其平均值，即为最终灰度值。

1.2.5高良姜多糖对酪氨酸酶的抑制率的测定。参照周盈利等的方法[13-14]，在3.5 mL反应液中加入2.9 mL 10 mmol/L邻苯二酚(用缓冲液配制)和0.5 mL不同浓度的高良姜多糖，以蒸馏水为对照组。加入0.1 mL酶液，迅速摇匀，倒入比色皿，5 min时，于410 nm波长处测定吸光度，并按下式计算酶活抑制率：

抑制率=(OD1-OD2)/OD1×100%

式中，OD1为未加抑制剂的吸光值；OD2为加抑制剂的吸光值。

采用寇氏改良法计算半数抑制率IC50值：

lgIC50=Xm-I[P-(3-Pm-Pn)/4]

式中，Xm为lg最大剂量；I为lg(最大剂量/相临剂量)；P为阳性反应率之和；Pm为最大阳性反应率；Pn为最小阳性反应率。

1.2.6色泽的测定。使用DC-P3自动色差仪测定色泽，结果以L*、a*、b*值表示。HunterL*值表示颜色深浅，L*值越大，表示颜色越浅，越有光泽；反之，L*值越小，表示颜色越深。Huntera*值表示红绿程度，a*值为“+”时表示红的程度，a*值越大，表示红色越深；Hunterb*值表示黄蓝的程度，b*为“+”时，表示黄的程度，b*值越大，表示黄色越深。

在100 mL烧杯中加入2 mL底物邻苯二酚和1 mL浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL的高良姜多糖和0.6 mg/mL抗坏血酸，然后加入10 mL酪氨酸酶液迅速混匀，加入比色杯中5 min后测定并记录反应体系的HunterL*、a*、b*值。

2结果与分析

注：阳性对照为0.6 mg/mL的抗坏血酸。Note：The positive control is 0.6 mg/mL ascorbic acid.图1　不同浓度高良姜多糖处理对马铃薯匀浆褐变(左)及褐变度(右)的影响Fig.1　Effects of different concentrations of A.officinarum polysaccharide on potato homogenates browning(left) and browning degree(right)

2.1高良姜多糖对马铃薯匀浆褐变度的影响马铃薯匀浆在40 ℃恒温水浴2 h后发生明显褐变，经不同浓度的高良姜多糖处理可以显著抑制其褐变的发生(图1左)，采用图像处理软件测定其灰度值(图1右)，可以看出0.2~1.0 mg/mL的高良姜多糖处理均能显著降低马铃薯匀浆的褐变度，且随多糖浓度增加褐变抑制作用愈明显。2.2高良姜多糖对酪氨酸酶促褐变的抑制作用灰度值越小，物系变色程度越深，即是褐变程度越大。由图2(上)可见，高良姜多糖对酪氨酸酶引起的底物褐变具有显著的抑制作用。试验前加入了底物邻苯二酚，加快了反应速度，采用Photoshop图像处理软件对培养皿内酪氨酸酶反应体系的灰度值进行定量分析。由图2(下)可知，对照组灰度值最低，以0.6、0.8、1.0 mg/mL的高良姜多糖和0.6 mg/mL的抗坏血酸处理后，酪氨酸酶的褐变程度明显低于对照组；而高浓度(0.8、1.0 mg/mL)的高良姜多糖处理后，灰度值高于0.6 mg/mL的高良姜多糖处理。这些结果表明，高良姜多糖对酪氨酸酶有抑制作用。在10 mL酪氨酸酶和2 mL邻苯二酚的条件下0.6 mg/mL的高良姜多糖抗褐变的能力相当于0.6 mg/mL的抗坏血酸作用的95.6%。

注：阳性对照为0.6 mg/mL抗坏血酸。Note：The positive control is 0.6 mg/mL ascorbic acid.图2　不同浓度高良姜多糖处理对酪氨酸酶褐变的灰度值的影响Fig.2　Effects of different concentrations of A.officinarum polysaccharide on the gray value of tyrosinase browning

2.3高良姜多糖对酪氨酸酶抑制率的影响从图3可知，随着高良姜多糖浓度的升高，高良姜多糖对酪氨酸酶的抑制率呈现上升趋势。以0.2~1.0 mg/mL的高良姜多糖和0.6 mg/mL的抗坏血酸处理后，对酪氨酸酶的抑制率明显高于对照组。在2.9 mL 10 mmol/L邻苯二酚和0.5 mL不同浓度的高良姜多糖以及0.1 mL酶液的反应体系中，0.6 mg/mL的高良姜多糖对酪氨酸酶的抑制率相当于0.6 mg/mL抗坏血酸作用的62%。采用改良寇式法求出高良姜多糖对酪氨酸酶的半数抑制浓度IC50为0.315 mg/mL。

注：阳性对照为0.6 mg/mL抗坏血酸。Note：The positive control is 0.6 mg/mL ascorbic acid. 图3　不同浓度高良姜多糖对酪氨酸酶的抑制率Fig.3　Inhibition ratio of different concentrations of A.officinarum polysaccharide on tyrosinase

2.4高良姜多糖对酪氨酸酶反应体系HunterL*值的影响由图4可知，随着高良姜多糖浓度的升高，不同浓度高良姜多糖处理酪氨酸酶后HunterL*值呈现上升趋势。对照组HunterL*值最低，以0.2~1.0 mg/mL的高良姜多糖和0.6 mg/mL的抗坏血酸处理后，HunterL*值高于对照组，且呈浓度依赖关系。在10 mL酪氨酸酶、2 mL邻苯二酚的反应体系下，0.2 mg/mL的高良姜多糖相当于0.6 mg/mL的抗坏血酸作用的122%。说明高良姜多糖含量增高对酪氨酸酶体系的亮度具有显著作用。

注：阳性对照为0.6 mg/mL抗坏血酸。Note：The positive control is 0.6 mg/mL ascorbic acid.图4　不同浓度高良姜多糖处理对酪氨酸酶反应体系Hunter L*值的影响Fig.4　 Effects of different concentrations of A.officinarum polysaccharide on Hunter L* value of tyrosinase reaction system

2.5高良姜多糖对酪氨酸酶Huntera*值的影响由图5可知，随着高良姜多糖浓度的升高，不同浓度高良姜多糖处理酪氨酸酶后Huntera*值呈现下降趋势，呈浓度依赖关系。对照组Huntera*值最高，以0.2~1.0 mg/mL的高良姜多糖和0.6 mg/mL的抗坏血酸处理后，Huntera*值低于对照组。在10 mL酪氨酸酶、2 mL邻苯二酚的反应体系中，0.6 mg/mL的高良姜多糖的作用相当于0.6 mg/mL抗坏血酸作用的45%，说明高良姜多糖处理显著降低了酪氨酸酶反应体系的红度值。

注：阳性对照为0.6 mg/mL抗坏血酸。Note：The positive control is 0.6 mg/mL ascorbic acid.图5　高良姜多糖处理对酪氨酸酶反应体系Hunter a*值的影响Fig.5　 Effects of A.officinarum polysaccharide on Hunter a* value of tyrosinase reaction system

2.6高良姜多糖处理对酪氨酸酶反应体系Hunterb*值的影响由图6可知，随着高良姜多糖浓度的升高，不同浓度高良姜多糖处理酪氨酸酶后Hunterb*值呈现下降趋势。对照组Hunterb*值最高，以0.2~1.0 mg/mL的高良姜多糖和0.6 mg/mL的抗坏血酸处理后，Hunterb*值低于对照组。而1.0 mg/mL高良姜多糖处理后，Hunterb*值低于0.2 mg/mL高良姜多糖处理。在10 mL酪氨酸酶、2 mL邻苯二酚的反应体系中，0.6 mg/mL的高良姜多糖作用相当于同浓度抗坏血酸作用的96%，说明高良姜多糖处理显著降低了酪氨酸酶反应体系的蓝度值。

注：阳性对照为0.6 mg/mL抗坏血酸。Note：The positive control is 0.6 mg/mL ascorbic acid.图6　高良姜多糖处理对酪氨酸酶反应体系Hunter b*值的影响Fig.6　Effects of A.officinarum polysaccharide on Hunter b* value of tyrosinase reaction system

3结论

该试验初步研究了高良姜多糖对酪氨酸酶活性的抑制作用，结果显示，不同浓度的高良姜多糖能显著降低马铃薯匀浆的褐变度、降低酪氨酸酶-邻苯二酚反应体系的颜色值，对酪氨酸酶活性具有显著的抑制作用，且存在量效关系，其半数抑制浓度IC50值为0.315 mg/mL。在Hunter值的探讨中，高良姜多糖抑制了HunterL*的下降和a*、b*值升高，表明高良姜多糖对保持酪氨酸酶反应体系的明亮度，防止色泽加深有较好的效果。对于酪氨酸酶抑制剂在食品和化妆品中的应用，抑制剂的安全性是首要考虑的因素。高良姜多糖是一种天然提取物，作为食品本身其安全性得到可靠保障。因此，高良姜多糖在食品工业上有很大的应用前景。该研究提示，高良姜多糖可用于美白护肤、果汁护色、鲜切果蔬保鲜等领域，值得进一步研究。

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收稿日期2015-12-30

作者简介杨达城(1992- )，男，广东惠州人，本科生，专业：食品科学与工程。*通讯作者，副教授，博士，从事食品功能因子及功效评价方面的研究。

基金项目广东省公益研究与能力建设专项资金(2015A020209166)；广东省大学生科技创新培育专项资金(pdjh2015b0254)。

中图分类号S 59

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)03-081-04