CellSearch系统对细胞检出率和线性度性能检测方法的研究

【作 者】陈信元，张芷菁

上海市医疗器械检测所，上海市，201318

CellSearch系统对细胞检出率和线性度性能检测方法的研究

【作 者】陈信元，张芷菁

上海市医疗器械检测所，上海市，201318

该文对CellSearch系统在细胞检出率和线性度性能检测方法进行研究，从而分析出适应CellSearch系统特征的准确合理的检测方法。

循环肿瘤细胞；细胞检出率；线性度；检测方法

恶性肿瘤严重威胁人类的健康，而转移是肿瘤患者最主要的死因。肿瘤的早期诊断对于患者的治疗至关重要[1]。循环肿瘤细胞的正确检测在肿瘤的诊断疗效和预后判断方面具有相当重要的意义。

在原发肿瘤形成和生长的早期，部分细胞会从原发灶脱落并进入血液循环，这些高度异质性的细胞被称为循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cells，CTCs），可能是肿瘤远处转移的一种标记。近年来，随着敏感分子技术的发展，使得分离、计数外周血CTCs成为可能。在疾病早期阶段，CTCs可能有助于良、恶性肿瘤的鉴别，转移风险的预测和判断。现有的CTCs分离、检测技术方法较多，各有利弊。富集方法通常是基于CTCs的物理性质（密度和大小）或免疫磁性，包括梯度离心法、过滤法、免疫磁性分选法等。检测方法包括免疫学技术、基于RT-PCR技术、酶联免疫斑点（ELISPOT）技术和CTCs芯片技术等[2]。其中，免疫磁性分选法是目前最常用的CTCs富集方法，也是CellSearch系统所采用的方法。其主要步骤包括：上皮细胞黏附因子（Epithelial Cells Adhesion Molecule, EpCAM）抗体磁珠用于捕获CTCs，细胞内角质蛋白荧光抗体（CK-PE）识别上皮细胞，白细胞荧光抗体（CD45-APC）识别白细胞，DAPI荧光核染料用于生成细胞图像。本文对CellSearch 系统在细胞检出率和线性度性能检测方法进行研究，使其在今后的仪器上市前的检测以及临床中的普适性有借鉴意义。

1 CellSearch 系统的组成

CellSearch 系统由Autoprep系统、Analyzer系统、Cellsave储存管以及配套的试剂组成。Autoprep系统是一种自动化样本处理器，结合CTCs专用检测试剂盒用于分离得到生物体液或全血中的罕见的已富集的样本。Analyzer系统是一种半自动荧光光学系统，可自动对分选的CTCs进行拍照、分析和计数，以图库形式呈现备选的荧光检测图像，便于检测者进行最终分类判读。Cellsave储存管内装有特定的细胞保护剂，能够帮助提高分析结果的可再现性和可靠性，同时确保CTCs能够在室温条件下稳定保存长达96 h，使得样本的长途运输成为可能。

2 细胞的检出率的研究

就目前而言，对于肿瘤细胞计数，不存在具有一个公认并且经过验证的计数标准，所以在大范围细胞浓度范围内，本研究对CellSearch系统用线性回归法对细胞的检出率进行估计。

在实验之初，考虑到每个数据点需要一个受试者7.5 mL全血，且分析数据需要花费数小时，这限定了现有设备每天可分析的数据点的数目，同时也限制了从健康受试者采集的血液样本的数量。

精准地测量检出率较为复杂，大部分细胞计数方法的有效检出率底限约为1×104个细胞/mL。而CellSearch系统采用的技术可应用在细胞浓度很低时，这个浓度远低于血球仪计和全自动血液检验设备的极限值。1 000个细胞/7.5 mL样本，即相当于约133个细胞/ mL，这个水平比具有代表性的血球仪计的极限要低两个数量级。对于系统灵敏度范围的下限，4个肿瘤细胞/ 7.5 mL全血，即仅0.53个细胞/mL。没有任何一种已知方法，能可靠地精准到这个水平。同时区别肿瘤细胞与血液中其他有形成分也存在问题。细胞计数可在浓缩的细胞原料上进行，然后再对细胞原料进行稀释，但是细胞计数法的误差需乘以一个很大的稀释因子，导致预期细胞计数产生很大、不可接受的不精确度。和CellSearch系统公司讨论研究后开发出一种流式细胞仪细胞计数方法，这种方法能够在比血液检验仪器所需浓度低的条件下对细胞进行计数，并且能够区分肿瘤细胞和血液中其他有形成分。

简而言之，采用流式细胞法测定加标细胞计数，测定全血样本标记原材料中肿瘤细胞即SKBr-3细胞的浓度。流式细胞仪绝对计数荧光粒子购自Bechman-Coulter公司。共用3个试管，每个试管均置入200 μL的ImmunipermTM、10 μL的抗角蛋白藻红蛋白和100 μL待测细胞悬浮液。然后将这些试管培养15 min，提高细胞的通透性和细胞角蛋白染色。另取2个试管接收500 μL的Autoprep系统缓冲液。然后将5个试管均放入购自Bechman-Coulter公司的20 μL荧光粒子(约26 000个)。把5个试管做涡旋式混合，在购自Becton-Dickinson公司的FACSCaliburTM流式细胞仪上运行放置缓冲液的2个试管。直到试管中100%的样本被操作完成。测定出所增加的荧光粒子实际的总数目。接着对3个试管进行操作，当收集到了13 000个荧光珠时，即试管约50%的样本被运行时，数据停止采集。然后根据已计数的荧光粒子的数目与荧光粒子总数目计算出两者之间的比值，从而计算出已运行的试样的体积。因此，如果待测细胞悬液在CellSearch系统中测出的细胞计数为200，那200则为待测细胞悬液所有获得细胞计数，乘上已计数的荧光粒子的数目与荧光粒子总数目，计算出两者之间的比值。最后就得到了待测细胞悬液所有获得细胞个数。

3 线性度检测方法的研究

采集5个受试者血液保存在Cellsave的储存管中，然后每个储存管分别重新配置成6个试管，每个试管装有7.5 mL受试者血液。在第一个试管中放入固定SKBr-3细胞悬液90 μL(约含有1.45×104个细胞/mL)，第一个试管作为最高细胞浓度，约为1 300个SKBr-3细胞加入到血样。然后将第二个90 μL细胞悬液与PBS缓冲液以1:3稀释，以此类推，制成在PBS缓冲液中的4个稀释度，PBS缓冲液中含有5%的BSA牛血清白蛋白。把各个梯度的细胞悬液加到各自相应的血样试管中。最后一个试管不添加细胞悬液。即每个受试者的6个试管中，分别含有1300、325、81、20、5和0个SKBr-3细胞。所有的30个试管全部分别混合，在室温下静置过夜，在处理前不再进行混合。然后把所有的试管都放置在同一台Autoprep系统上运行。并在同一台Analyzer系统处理。

表1中列出了在宽广范围内的细胞浓度的实测细胞计数和预期肿瘤细胞计数的对比。在这个实验中在最高肿瘤细胞浓度中的5个结果中，平均检出率为93%。分析后细胞损失可能为：1）通过Autoprep系统制备回收7.5 mL血样中的肿瘤细胞的回收率仅为93%；2）通过CellSearch 系统检测到仅存在93%的肿瘤细胞；3）上述两种均有。

表1 实测与预期肿瘤细胞数目Tab.1 The observed and expected number of tumor cells

表2 检测偏差Tab.2 Detection deviation

表1和表2列举了用CellSearch 系统测出的全血中肿瘤细胞数目与加入样本中的肿瘤细胞数目是基本一致的。在实验中每个浓度的相对精度在93%到140%范围间。从数据上看，低细胞浓度范围使用该比较方法是不精准的，在最低细胞浓度范围中，偏差2个细胞的相对偏差近乎一半。综合考虑，所有数据用最小二乘拟合方式线性回归见图1。

图1 预期细胞数目—实测细胞计数线性回归分析Fig.1 The expected number of measured cell - cell count linear regression analysis

图1 直观地列出了实测肿瘤细胞计数和预期肿瘤细胞计数对比。回归曲线的斜率为0.932。R2大于0.95说明X轴选择的数据范围是足够的。曲线中斜率0.932说明约93%肿瘤细胞放进样本中。R2等于0.999说明实测肿瘤细胞数目与加入样本中的肿瘤细胞数目是线性一致的。回归数据表明截距为3.867。95%的置信度区间为[-2.31, 10.04]，且过零。因此在统计上无异于零。

如图1，本实验中CellSearch 系统可以精确地测出加入了SKBr-3肿瘤细胞的全血样本中肿瘤细胞的数目且能测出最大的肿瘤细胞达1 238个。结果表明CellSearch 系统所检测出的数据是线性的，与临床相关肿瘤细胞数目是线性一致的，所用计数方法是合理的。

由于图1中的斜率是0.932而不是1，在前面已经分析过0.93%的原因。为了排除掉检出率这个变量的因素，采用稀释系列中最高细胞数目来设置系列中后续稀释度的预期细胞数目，即我们认为最高细胞数目的测量是100%准确的。这样将回收率与最高肿瘤细胞浓度样本的检出率分开来考虑，后续试管的预期值为最高试管的实测值除以稀释因子。分析得知斜率必须为1，截距在统计上等于0，更高的R2，以表示93%的回收率是采样不能捕获7%的细胞，而不是系统未检出这7%的细胞。于是CellSearch 系统的检测是线性的，检出率在受试肿瘤细胞范围内是一致的，表3和图2显示了这一分析结果。

表3 连续稀释的实测与预期肿瘤细胞数目Tab.3 The observed and expected number of tumor cells continuously diluted

图2 预期细胞数目—实测细胞计数线性回归分析Fig.2 The expected number of measured cell-cell count linear regression analysis

表3中的实测值与表1所列的值相同，然而，预期值发生变化。因为预期值是通过最高浓度样本的实测值连续除以稀释因子得到的，是按比例稀释的理想状态。另外，对于图2中的线性回归中，对于每个受试者的最高肿瘤细胞数目的预期值和实测值都被除外，因为已经假设为相等的，计算出预期值，与实测值相比较，仅是用于人工的改善分析。

图2显示了CellSearch 系统对肿瘤细胞连续稀释度的响应。对实测肿瘤细胞数与预期肿瘤细胞数进行回归分析，生成的斜率1.007，截距3.028，R2等于0.990，R等于0.995。因此，一旦样本的回收率被计算出，在很大的肿瘤细胞试样范围内，该比例都不会变化。在该研究中，在4～255个细胞范围内，斜率为0.994，截距为5.712，R2等于0.991。图1和图2的数据证实，CellSearch系统在受试肿瘤细胞范围内是线性的（0～1 238个细胞）。回归数据分析表明，截距3.028，95%的置信区间为[-3.3, 9.22]，这个区间与零重叠，因此在统计上无异于零。

CellSearch 系统在广泛的临床相关范围内肿瘤细胞检出率是基本一致的，线性的。检出率可能因受试者不同而不同；然而，斜率0.932或1.007表明，对于一个受试者，检出率是不应受试细胞变化而变化的，因此，当肿瘤细胞数目变化时，CellSearch系统的响应是1:1的。R2等于0.999和0.990证实，CellSearch系统响应的线性度符合预定用途，且两种检验方法都是可取的。

4 结论

通过对CellSearch 系统采用流式细胞法计数从而解决对低浓度条件下血液检测仪器无法进行计数的问题，检验出最终结果CellSearch 系统的检出率达到93%。其中7%的细胞损失可能是Autoprep系统在采样回收中的损失，或是Analyzer系统的检测性能的限制。为了排除这93%的回收率是否由Autoprep系统或是Analyzer系统造成的而采取了连续稀释法进行分析，最终得到斜率为1.007，R2等于0.990。也就是说当预期细胞数目增加多少，CellSearch 系统检测到的细胞数目也增加多少，证明了CellSearch 系统的有效性。

通过对CellSearch 系统对细胞检出率和线性度性能检测方法的研究，试验出了一套可行的针对低浓度范围细胞检测仪器的检验方法，为上市前类似仪器的线性度检验方法总结出了实际检验意义。

[1] Hanahan D, Weinberg RA. Hallmarks of cancer: the next generation[J]. Cell, 2011, 144(5): 646-674.

[2] Paterlini-Brechot P, Benali NL. Circulating tumor cells(CTC) detection: clinical impact and future directions[J]. Canc Lett, 2007, 253(2): 180-204.

Study on the Detection Rate of Cell and Linearity Performance Detection Method in the CellSearch System

【 Writers 】CHEN Xinyuan, ZHANG Zhijing
Shanghai Testing & Inspection Institute for Medical Devices, Shanghai, 201318

circulating tumor cells, detection rate of cells, linearity, detection method

R318.6

A

10.3969/j.issn.1671-7104.2016.01.017

1671-7104(2016)01-0058-03

2015-02-27

陈信元，E-mail: 18621687007@163.com

【 Abstract 】Research on CellSearch system's detection rate of cells and linearity performance detection method, so as to analyze the accurate and reasonable detection method to meet the CellSearch characteristics of the system.