响应面优化复合酶提取夏枯草多糖

金辰光，陈瑞战，谭　莉，常清泉，陆　娟，章雯雯

(长春师范大学化学学院，吉林长春 130032)



响应面优化复合酶提取夏枯草多糖

金辰光，陈瑞战，谭莉，常清泉，陆娟，章雯雯

(长春师范大学化学学院，吉林长春 130032)

[摘要]本文探索和优化一种高效的复合酶解技术从夏枯草中提取多糖。在单因素试验的基础上，选择酶添加量(A)、提取温度(B)和溶液pH值(C)三因素三水平的Box-Behnken Design(BBD)试验设计，响应面优化提取工艺。得到最佳提取条件：纤维素酶浓度0.4%、果胶酶浓度0.8%、木瓜蛋白酶浓度0.8%，提取温度61℃，pH 6.2。在此条件下夏枯草粗多糖的提取得率为11.57±0.48% (n=3)，与预测得率(12.01%)基本一致。说明优化得到的工艺合理、可行，复合酶提取得率高、能耗低，是一种很有希望的提取方法。

[关键词]夏枯草；多糖；复合酶；优化

夏枯草(PrunellavulgarisL.)为唇形科(Labiatae)，夏枯草属(Prunella)植物，多年生草本。广泛分布于欧亚温带地区及热带山区，主要含有多糖[1]、黄酮[2]、三萜、甾醇、有机酸、挥发油及其苷类等活性成分[3]，有免疫增强[4]、抗肿瘤、抗氧化[1]、抗结核[5]，清肝、明目、清热、散结等功效[6]。糖生物学研究表明，多糖具有增强机体免疫功能[7]、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化[5-6]、抗衰老等多种生理活性，广泛应用于功能性食品、医药、生物材料等领域。

多糖的提取是多糖研究的基础，它不仅影响提取得率，还影响多糖的结构和活性[8]。多糖提取方法有热水浸提、酸碱浸提、超声辅助提取[9]、微波辅助提取以及酶解提取等[10]，其中酶解提取具有得率高、温度低、活性高等优点[11]。但复合酶解提取夏枯草多糖的研究还未见报道，因此，本文采用复合酶提取夏枯草多糖，并且对提取工艺进行了优化，为夏枯草资源的综合利用提供理论依据。

1材料与方法

1.1仪器与材料

夏枯草果穗晒干并用高速粉碎机碎成粉末，过60目筛备用；截留分子量3500Da透析袋(北京瑞达恒辉科技有限公司)；旋转蒸发仪(N-1100，上海爱朗仪器有限公司)，高速离心机(Heraeus Multifuge X1R，德国)，紫外可见分光光度计(UV-1601，北京北分瑞利分析仪器)；纤维素酶(TCI化城工业发展有限公司，日本，25000U/g)、果胶酶(TCI化成工业发展有限公司，日本，40000U/g)、木瓜蛋白酶(国药集团化学试剂有限公司，6000U/mg)，硫酸、苯酚、三氯甲烷、正丁醇、无水乙醇等均为国产分析纯。

1.2酶解法提取多糖

夏枯草粉末分别用石油醚、95%乙醇回流两次，脱脂、脱色、除去低聚糖和小分子杂质，最后挥干溶剂，得到预处理样品。

称取3g预处理样品，加入适量蒸馏水，浸泡6h，按照选定的加酶量(纤维素酶：果胶酶：木瓜蛋白酶=1∶2∶2)、酶解温度和pH值在水浴锅中提取60min，提取完成后沸水浴灭活2min。提取溶液离心，收集上清液并减压浓缩至原体积的20%以下，加入无水乙醇至乙醇最终浓度为80%，在4℃温度下沉化24h。离心后收集沉淀，利用Sevag法脱蛋白，用截留分子量3500Da的透析袋流水透析48h，最后冻干得到夏枯草粗多糖 (PPs)。采用硫酸—苯酚法测定多糖含量[6]。PPs提取得率(Y)公式:Y (%) = (M/W) ×100%，其中M是多糖的含量，W代表样品净重。以葡萄糖浓度(C)为横坐标，吸光度(Abs)为纵坐标，线性拟合绘制葡萄糖标准曲线，获得回归方程为：

Abs=0.06329C-0.03835(R2=0.9994).

1.3热回流提取多糖

预处理后的样品加适量蒸馏水浸泡6h，在100℃温度下回流提取2h，离心收集上清液，反复操作两次，合并提取液。提取液按照前文1.2小节中的步骤处理。

1.4响应面优化实验设计

在单因素试验的基础上，利用Box-Behnken Design (BBD)中心组合设计，以PPs提取得率Y(%)为响应值，考察三个独立变量：加酶量(A)、酶解温度(B)和pH值(C)(每个因素取 3 个水平)对提取得率的影响。实验设计和PPs得率如表1所示，所有试验均进行3次；并利用Design Expert(8.0版)软件进行数据分析。采用ANOVA法进行方差分析。在P<0.05时有统计学意义。

表1　夏枯草多糖提取率的响应面试验方案及结果

2结果与分析

2.1单因素对多糖得率的影响

如图1a所示，在固定酶解温度60℃、水料比5mL·g-1和pH值为6条件下，复合酶添加量在0.25%~2.5%时与多糖得率成正效应关系，之后进一步增加酶添加量时则多糖得率下降。说明3种生物酶对植物细胞组织具有很好的酶解功能，并能够提高多糖在水中的溶解性[12]，总量高于2.5%后多糖得率开始下降，其原因可能是多糖被过量的纤维素酶、蛋白酶和果胶酶降解所致[13-14]。所以酶添加量应选择在1.5%～2.5%之间。

固定酶添加量为2%、pH值为6、酶解温度为55℃，水料比对多糖提取得率的影响如图1b所示。在20～50 mL·g-1的水料比范围内，随水料比的增加，多糖的提取得率增加，当水料比超过50mL·g-1后，多糖得率不再明显增加，说明多糖在水料比为50mL·g-1时可以充分溶解在溶剂中。在一般情况下，水料比高，组织细胞内外的多糖浓度梯度大，利于多糖由组织细胞内部向周围提取溶剂的扩散，提取得率增加。但过分增大水料比会增加后处理的工作量，降低提取效率。故而在响应面实验中将水料比固定在50mL·g-1。

如图1c所示，在固定其它实验条件情况下，酶解过程中的pH对多糖的提取得率的影响较为复杂。在pH为3~4时，多糖得率与pH值成反效应，可能是过酸条件下，酶的空间结构受到了破坏，影响了与底物的结合，从而使提取得率下降[12,14]。而pH值从4升高到7时，多糖得率大幅升高，之后又再次降低，说明提取过程中过高的pH值会降低酶的活性。所以，应选择在pH值4～6下进行酶解提取。

如图1d所示，当酶添加量为2%、水料比为50mL·g-1、pH值为6时，在温度由30℃提升到60℃的过程中，多糖提取得率稳步上升，表明温度可以改进多糖的传质效率，随着提取温度的提高，多糖在溶剂中的溶解度、扩散系数增大，提取溶剂的粘度降低，这些都有利于多糖的提取。然而，过高的温度也可能会破坏多糖的结构，导致其在提取过程中降解[8,10]，提取得率降低。因此，选择60℃左右的提取温度较为适宜。

图1　酶添加量(a), 水料比(b), pH(c)和酶解温度(d)对多糖提取得率的影响

2.2响应面优化结果与分析

2.2.1模型拟合与统计分析

根据单因素试验确定的各项实验条件范围，选择酶添加量、酶解温度和pH值三个因素，每三因素取三个水平进行BBD试验设计，试验设计及结果如表1所示。通过软件模拟出各因素对提取得率的二次多项式为：Y(%)=11.57-0.32A+0.29B+0.78C+0.44AB-1.54AC+0.55BC-1.53A2-0.59B2-2.82C2.

方差分析(ANOVA)结果如表2所示。F值(65.32)和P值(P<0.0001)的结果表明模型极其显著。同时失拟项F值(0.074)和P值(0.9708)表明失拟不显著，说明实验值与预测值之间有良好的关联性。决定系数(R2=0.9882)，调整后的决定系数(R2=0.973)也证实该模型是高度显着的。同时，变异系数(CV%=3.62)也表明实验值的高度可靠性。从表2还可看出线性相关系数(A，B和C)，二次项系数(A2，B2和C2)和交互项系数(AB，AC和BC)均显著(P<0.05)。其中交互项系数AC与二次项系数A2和C2极显著(P<0.0001)。

表2　拟合二次多项式模型的方差分析

注：* P<0.05, 显著；** P<0.0001, 极显著。

2.2.2响应面分析

酶解法提取夏枯草多糖工艺中酶添加量、酶解pH值和酶解温度3个因素之间交互作用对多糖提取得率的影响如图2所示。

图2　酶添加量(A)、提取液温度(B)、溶液pH(C)两两交互对提取得率的影响

当溶液pH值固定在6时，酶添加量(A)，酶解温度(B)和它们相互作用对多糖得率的影响如图2a和图2b所示。两项因素对多糖得率的影响均成抛物线形，即随酶添加量和酶解温度的增大，多糖得率呈先增大后降低的趋势，因此在提取工艺中适当增加酶添加量和酶解温度可以提高多糖得率[12]。由图2c和图2d可知，随着溶液pH值(C)和酶添加量(A)的增大提取得率逐渐增加，在pH值为6.4 和加酶量为1.8% 时夏枯草多糖的得率达到最大值；当溶液pH值和酶添加量继续增大时，多糖得率开始降低，因此在实际生产中应控制酶用量和溶液pH值。由图2e和图2f 和方差分析可知，溶液pH值(C)和酶解温度(B)的交互作用中，溶液pH值对夏枯草多糖得率的影响极显著，且在固定酶添加量时酶解温度对多糖的影响程度远不及溶液pH值的影响，两项交互作用的影响也在中心条件附近达到最大。

由表2和图2可知，酶解法提取夏枯草多糖的工艺参数中，各因素对多糖得率的影响顺序为：酶解pH值>酶添加量>酶解温度>水料比。其中酶添加量、酶解温度和酶解pH值均达到极显著水平。由表2可知，酶解温度、酶添加量与溶液pH值都存在交互作用，其中溶液pH值与酶添加量的交互影响达到极显著水平。

2.3不同提取方法的比较

复合酶解法提取得率为12%，比热回流法高出3%，说明酶解法提取多糖更加高效；且复合酶可以降解蛋白质等杂质，提高了多糖的纯度；与传统热回流法比较，酶解提取的温度为61℃，而热回流提取的温度是100℃，酶解法提取温度较热回流提取大幅降低，这样既降低了杂质成分的溶出，又最大限度地保持了多糖的活性。实验结果说明复合酶解法提取夏枯草多糖工艺优势明显，具有良好的发展前景。

3结论

本研究采用复合酶解法提取夏枯草多糖，该工艺通过酶水解破碎植物细胞壁的作用，使细胞内多糖物质充分溶出，从而显著提高了夏枯草多糖得率。各因素对夏枯草多糖提取得率的影响次序为：酶解pH值>酶添加量>酶解温度>水料比。最佳提取工艺条件为：酶添加量2%(纤维素酶0.4%、果胶酶0.8%、木瓜蛋白酶0.8%)、水料比50mL·g-1、酶解温度61℃、酶解pH 6.2；在此最佳条件下，复合酶法提取夏枯草多糖的得率为11.57 ± 0.48%，与模型预估值12.01%接近，说明优化得到的模型准确、可靠。建立的提取工艺较常规的提取方法，得率高、条件温和，可以广泛应用于植物活性成分的提取。

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Response Surface Optimization of Complex Enzyme Extraction Polysaccharides fromPrunellaVulgaris

JIN Chen-guang, CHEN Rui-zhan, TAN Li, CHANG Qing-quan, LU Juan，ZHANG Wen-wen

(Faculty of Chemistry, Changchun Normal University, Changchun Jilin 130032, China)

Abstract:In this study, an efficient complex enzyme extraction (CEE) technology was developed and optimized to extract polysaccharides from Prunella vulgaris. On the basis of single factor test, response surface methodology (RSM) based on a three-factor three-level Box-Behnken Design (BBD) was employed to optimize the extraction conditions including enzyme concentration, extraction temperature and pH. The optimal extraction conditions were as follows: cellulase 0.4%, pectinase 0.8%, papain 0.8%, extraction temperature 61℃, pH 6.2. Under these conditions, the experimental yield was 11.57 ± 0.48%, which is well in close agreement with the value predicted (12.01%) by the model. These results demonstrated that the optimal extraction technology is reasonable and feasible. The CEE is a promising extraction method that offers higher yield and lower energy cost.

Key words:Prunella vulgaris; polysaccharides; complex enzyme; optimization

[通讯作者]陈瑞战(1967- )，男，教授，博士，硕士生导师，从事天然有机化合物研究。

[作者简介]金辰光(1988- )，男，硕士研究生，从事天然有机化合物研究。

[基金项目]吉林省教育厅“十二五”科学技术重点项目([2014]258，[2015]355)；长春师范大学研究生教育创新计划(cscxy2014003)。

[收稿日期]2015-11-10

[中图分类号]O629.12

[文献标识码]A

[文章编号]2095-7602(2016)02-0049-05