法医硅藻检验关键技术及设备研发*

广东省公安厅科技信息化处科技管理科

（广东省公安厅，广东 广州510050）

法医硅藻检验关键技术及设备研发*

广东省公安厅科技信息化处科技管理科

（广东省公安厅，广东 广州510050）

1　项目基本情况

水中腐败尸体的死因鉴定是世界公认的法医学难题，在公安部重点研究计划项目资助下，课题组开展法医硅藻检验关键技术和设备研发，并取得重大突破：建立了微波消解新方法，该方法高效、环保，硅藻回收率高；建立了真空抽滤富集硅藻方法，发明了自动化多联真空抽滤设备，避免了硅藻损失；建立了扫描电镜观察新方法，种属鉴定准确，避免了硅藻漏检、误检；研发了膜透明-光镜联用法，解决了硅藻检验技术在基层难以推广的难题；研究了硅藻脏器分布，规范了检材提取；建立全国主要水域硅藻分布数据库，编著了《法医硅藻学扫描电镜图谱》，解决了法医学工作者难以鉴定硅藻种属的难题；制定了行业标准，规范了硅藻检验操作程序，避免假阳性和假阴性，使硅藻检验备受争议的问题得到解决；已获国家专利5项、发表文章43篇（SCI/EI收录15篇）、专著1部；培养博士、硕士6名。

2　项目实施背景

水中尸体是法医学尸体检验中最常见的类型之一。据2014年世界卫生组织发布的《全球溺死报告》，每年全世界有37.2万人溺死，平均每小时42人溺死，2012年仅中国就有约6万人溺死。水中尸体死因鉴定是法医学必须解决的首要问题，也是案件定性的关键。对于新鲜的水中尸体，可通过口鼻部蕈样泡沫、水性肺气肿、呼吸道内泥沙等溺死的典型征象进行溺死鉴定。然而80%以上的水中尸体被发现时呈高度腐败，各种溺死征象不复存在，且尸体解剖及组织学检验无与溺死相关的特异性病理学改变，其死因鉴定成为世界公认的难题。由于死因不明、案件无法定性，极易导致家属不满、媒体炒作，引发群体性事件，如美国“2013· 2·19蓝可儿事件”等。水中腐败尸体的死因鉴定成为急需解决的重大难题。

为了解决上述难题，法医学工作者先后研究了硅藻检验、血液生化检验、异物元素检验、植物花粉孢子检验、叶绿素a检验等方法，然而除硅藻检验外，其他方法仅限于实验研究，未能在法医学实践中应用。硅藻广泛生活于各类水体，种类有16000多种，大小在1μm～200μm之间；硅藻对水质敏感，水环境不同，硅藻群落亦有差异；硅藻细胞壁高度硅质化，即使浓硫酸、浓硝酸煮沸也难以破坏其纹理特征。由于生前入水者的主动呼吸，硅藻可随溺液吸入肺泡，进入血液循环，分布到各组织器官；通过对脏器组织和水中的硅藻进行定性定量分析与比对，不仅可直接判断死因，而且有助于推断溺死地点。因此，如何从水中尸体组织器官，尤其体循环脏器中检出硅藻并准确鉴定其种属成为国内外法医学者关注的焦点。

自1904年Revenstorf从肺切面液体中首次观察到硅藻后，一个多世纪以来，产生了许多种硅藻检验方法，但这些方法的差异主要体现在有机质消解方面，消解方法包括强酸消解法、酶消解法、组织溶解剂法、硅胶梯度法、微波消解法等。尽管硅藻检验有一百多年历史，国内外硅藻检验实验室一直采用的强酸消解、离心富集、光镜观察技术并没有突破，存在显著缺陷。表现在：（1）缺乏行之有效的取材及检验规范，取材随意、送检及检验开放、步骤繁琐、容易污染，产生假阳性。（2）由于消解不彻底、反复离心损失等导致溺死尸体检出率低；对于硅藻含量少的体循环脏器，极易得到假阴性的结果。（3）溺死尸体肝、肾、骨髓等脏器组织中的硅藻一般个体小，含量低，受放大倍数所限，采用光镜检测时，因个体小、纹理特征难以辨识，这些微型硅藻易被忽略或其种属不能被准确鉴定；另一方面，又可能将其他异物误认为硅藻，因此极易导致漏检、误检的发生。（4）对环境及人体有害、劳动强度大。上述缺陷是导致硅藻检验结果产生质疑、难以推广应用的主要原因。国内仅有屈指可数的实验室开展硅藻检验，且多数情况下只做肺脏的检验。可见，针对硅藻检验上述的三个关键环节，整体研发防污染、灵敏、高效、环保的硅藻检验技术及设备，十分迫切。

3　项目主要内容

3.1首次规范了硅藻检材提取方法

传统的法医学硅藻检验研究多集中于有机质消解，很少有学者关注硅藻检验检材提取部位的研究。课题组在对62只新西兰大白兔、32头五指山猪溺死脏器硅藻分布研究的基础上，以30具不同水体典型溺死尸体作为研究对象，对肺、肝、肾、脾、心血、股骨骨髓的硅藻分布进行了系统研究，明确了相关脏器取材部位、规范提取送检程序，相关内容编入行业标准及本科教材。

3.2首次建立了微波消解提取硅藻新方法

通过实验优化，首次建立了采用浓硝酸-过氧化氢密闭式微波消解体系以及梯度微波消解程序的硅藻提取新方法，该方法消解时间仅需20min，有机质消解完全，硅藻外壳结构特征完整，消解过程密闭，可有效防止假阳性、有害气体对环境和人体的损害。该方法已获国家发明专利，论文在《Forensic Science International》、《中国法医学杂志》等刊物发表。

3.3首次建立了膜过滤富集硅藻方法

目前国内外法医学实验室均采用离心方法富集硅藻，采用2500～4000rpm离心15～25min，重复上述步骤3～5次直至上清液酸碱度达到6.5～7.5。课题组研究发现离心导致了大量硅藻的损失，例如4000r/min离心15min一次硅藻损失在29.94%至49.60%（34.18±9.19%）之间，其中最长径小于40μm的硅藻占到了90%以上，而这些硅藻恰是体循环脏器的主要类型。离心损失是导致溺死尸体体循环脏器硅藻检验阳性率低的主要原因。为避免离心所致的硅藻损失，课题组发明了一种基于膜过滤的硅藻富集方法，该方法已获国家发明专利，研究论文发表于《International Journal of Legal Medicine》、《法医学杂志》。

3.4发明了真空抽滤富集硅藻设备

由于滤膜孔径小，滤液在自然重力作用下难以通过滤膜，课题组基于真空抽滤的设计思路，先后研发了单联真空抽滤装置、多联真空抽滤装置，最终发明了多联真空抽滤设备，并实现产业转化。该设备的关键管路，容器，阀门以及真空泵以及密封元件，采用高强度耐腐蚀元件设计，可长期耐受抽滤操作过程中强酸性液体的腐蚀，防止危险液体的泄漏；采用专利的气路通道结构设计，以及微电脑结合传感器智能控制，保证多联抽滤中6通道的压力均匀，稳定，保证抽滤效果的一致性；专利真空抽吸管路结构设计，避免因发生虹吸现象使真空泵受损；采用触摸屏控制，提供方法编写平台，用户可根据工作需要自行设定自动抽滤程序。该设备已申请专利3项，其中2项已获授权。

3.5首次建立了扫描电镜观察硅藻新方法

传统光镜法检测硅藻时，须以人工方式对每个视场进行观察，且受光镜景深限制，从一视场移动至下一视场时，需重新调焦，检验效率低。本方法根据扫描电镜景深大（是光镜的数百倍）、移动视场时无需重新调焦的特点，以自动扫描方式拍摄并存储每个视场图像，大大降低了检验人员的劳动强度，提高了检验效率。而且，该法避免了光镜检测时受分辨率所限，微型的舟形藻、卵形藻、曲壳藻等硅藻容易被漏检、或难以根据其表面纹理鉴定种属的不足。

3.6发明了滤膜透明化技术

我国省部级、省会市实验室几乎都配备扫描电镜，微波消解-真空抽滤-扫描电镜联用法在实际应用中获得了很好的效果，推广应用前景良好。但我国大多数县（区）级实验室都未配备扫描电镜，限制了该方法在基层实验室的推广应用。为此，课题组经大量实验研究，发明了一种滤膜透明化试剂，滤膜经该试剂透明化处理后可在光镜下观察，从而解决了真空抽滤与光镜难以联用的难题。采用微波消解-真空抽滤-光镜联用法，可避免离心造成硅藻损失，经济、实用，可在基层法医实验室推广。该技术已申请国家发明专利，研究论文发表于《南方医科大学学报》。

3.7首次建立了我国主要水域硅藻分布数据库，确定了溺死相关主要硅藻

溺死尸体脏器中的硅藻分布与溺液中的硅藻分布具有相关性。通过对水中尸体脏器和水样中的硅藻种类、数量进行比对分析，不仅可诊断溺死，而且有助于推断溺死地点。因此，分析不同水体中的硅藻群落，建立硅藻分布数据库，对于溺死诊断和溺死地点推断均具有重要意义。课题组根据我国主要河流（包括黄河、长江、珠江及其他河流）的地理位置、流经顺序和主要湖泊的分布情况，确定了采样地点，收集了我国主要河流和湖泊水样3000多份。经分析，所有水样中共检出27种硅藻（分类至“属”），拍摄照片2万多张，出版了《法医硅藻学扫描电镜图谱》，该图谱对同行进行硅藻检测和种属鉴定，诊断溺死具有重要的应用价值。而且，经对我国主要水域硅藻种类和溺死尸体脏器中硅藻种类的比较分析，确定舟形藻、菱形藻、小环藻、针杆藻、异极藻、桥弯藻等8类为溺死相关主要硅藻。研究成果发表于《Australian Journal of Forensic Sciences》等杂志。

4　应用程度及成效

该项目在水中尸体尤其是水中高度腐败尸体的法医死因鉴定方面有重大突破，极大地提高了我国法医病理鉴定水平，解决了传统硅藻检验方法操作繁琐、检出率低、易污染、假阳性高、对人体有害、难以推广的难题。该成果于2012年被列为公安部重点成果推广项目、2013年被列为公安部行业标准。已应用于全国各地600多宗疑难案件，均作出准确的鉴定，有效地避免了死因无法确定导致错案、上访及群体事件，为案件的定性及处置发挥了关键作用，为维护司法公正和社会稳定作出了巨大贡献，取得了显著的社会效益。研究成果应用于30多家单位，并在国内外重要学术会议上与各国专家学者交流，受到国内外同行的广泛认可。

*广州市刑事科学技术研究所完成的“法医硅藻检验关键技术及设备研发”获2015年度公安部科学技术奖一等奖。