细菌与藻类生物在溺死诊断中的研究进展*

李　鹏　徐曲毅　刘　超，

（1.南方医科大学法医学系，广东 广州510000；2.广州市刑事科学技术研究所，广东 广州510000）

细菌与藻类生物在溺死诊断中的研究进展*

李鹏1徐曲毅2刘超1，2

（1.南方医科大学法医学系，广东 广州510000；2.广州市刑事科学技术研究所，广东 广州510000）

法医工作中，水中尸体“生前溺死”的判断是法医病理学尸检案例中的一个难点和重点。硅藻检验是溺死诊断常用的实验室检验方法，被认为是溺死诊断的“金标准”。近年来研究表明，除在溺死尸体脏器中存在硅藻外，其它不同于硅藻藻类与细菌类等生物也存在溺死尸体脏器与血液中。本综述主要就存在溺死尸体脏器或血液中的藻类与细菌的种类及其相关检测方法，旨在使人们了解藻类与细菌类等生物在溺死诊断中的研究现状。

法医病理学溺死藻类细菌

溺死的判定在法医实践中是一项常见的工作和难题［1］，它通常建立在对尸表检查、尸体解剖、及实验室检查等结果综合分析的基础上进行判断［1，2］。当尸体腐败时或白骨化时，由于尸表等溺死征象消失，此时硅藻检验是辅助推断溺死不可或缺的辅助手段［2］。近年来，除硅藻外，在溺死尸体脏器中同时检出蓝藻［3］、绿藻［4］等其它藻类得到证实。除藻类外，研究表明，与硅藻体积（＞2μm）相比，一些细菌（＜2μm）类如水生细菌等体积更小的生物更易随溺液进入溺死者体内分布到血液与脏器中，同时研究表明若根据细菌种类区别可对溺死尸体进行溺死地点的判断［5］。因此，在水中尸体脏器与血液中发现上述细菌、藻类等生物可对溺死诊断的判定具有重要的参考意义。本综述主要对发现可在溺死过程中随溺液进入血液循环的生物及相关的检测方法进行概述。

1　在溺死尸体脏器中发现的藻类、细菌类生物

溺死是液体媒介（通常是水）阻塞呼吸道（鼻和口）而引起的死亡［6］。在溺死过程中，由于肺泡、毛细血管屏障损伤导致水中存在的一些藻类或细菌，及存在正常人体喉部的细菌均有可能随溺液进入体液循环，进而到达人体各器官。下述生物是研究证实可进入溺死人体血液循环的相关藻类、细菌。

1.1藻类

1.1.1硅藻（Diatom）

硅藻是国内外溺死诊断研究最多同时也是最详细的藻类。硅藻因其独特的硅质细胞壳，在高温及强酸等条件不易被破坏，同时在各种水域中分布广泛，至今仍然是溺死诊断的重要依据，尤其是对于尸体腐败的案例［2］。目前，溺死尸体脏器中已发现多种硅藻，但不同水域中存在的硅藻种类与数量有差异。因此，有学者呼吁建立不同水域硅藻数据库，对推断溺死及溺死地点具有积极意义［2］。

1.1.2蓝藻（Cyanobacteria）

据有关报道，蓝藻存在于溺死尸体脏器中［3］。蓝藻也称蓝细菌，是地球上现存最古老，最简单、最原始的生物之一。蓝藻种类繁多，分布极其广泛。蓝藻能生存于各种类型水生环境。在淡水、海水、盐池，潮湿等环境均有分布［7］。2013年，Tie J［3］等人对溺死人体脏器肺、肝、肾等检材分别同时取5mg、10mg、20mg进行分子生物学检测，结果均为阳性，其检材量远小于硅藻检验所需检材量［8］。同年，Kakizaki E［4］等人使用454焦磷酸测序方法对溺死人体血液与脏器进行检测发现多种蓝藻可进入溺死人体脏器中，见表1。

表1　溺死尸体血液中存在的蓝藻Table 1.The Cyanobacteria existed in blood of drowning victims

上表表明多种蓝藻种属存在溺死尸体脏器中，并且据报道蓝藻在正常人体内不存在［4］，可避免尸体解剖过程中造成的污染，因此其有望成为辅助诊断溺死的新对象。

1.1.3其它藻类

除上述硅藻、蓝藻等藻类存在溺死尸体脏器中，有研究报道，绿藻［4］、甲藻［9］等中的一些种类也存在溺死尸体脏器中，研究较少。

1.2细菌类

近年来，有研究报道水生细菌及存在人体喉部的正常菌群也可随溺液进入溺死人体脏器中，可为溺死诊断提供证据。

1.2.1淡水中细菌（Freshwater bacteria）

受水中环境影响如盐浓度影响，海水与淡水中生存的细菌种类有差别，进而引起不同水域进入溺死人体脏器中的细菌产生差别，可用于推断溺死及溺死地点。淡水中存在且进入溺死尸体脏器中的细菌种属主要为气单胞菌属（Aeromonas）中的菌种［5，10］，见表2。

1.2.2海水中细菌（Marine bacteria）

适应生存在盐浓度较高即海水的水环境中且被发现可随溺液进入溺死人体脏器的海水中的细菌主要种属属于杆菌属（Photobacterium）、弧菌属（Vibrio）［5］中的菌种，见表2。

表2　溺死尸体血液中存在的淡水与海水细菌Table 2.The freshwater and marine bacteria existed in blood of drowning victims

1.2.3喉部菌群

在溺死过程中，溺液可冲刷存在于人体喉部、口腔中的正常菌群如唾液链球菌（Streptococcus salivarius）、血链球菌 （Streptococcus sanguinis），使上述细菌随溺液进入血液循环到达各脏器与血液中而在溺死尸体脏器中被发现［11］。因其存在人体特殊部位，在一些案例如溺死在浴缸中因水中细菌与藻类较少或不存在时，检测溺死尸体脏器中上述细菌的存在与否来判定溺死是很有意义的方法。

1.2.4细菌粪大肠菌、粪链球菌

溺死诊断研究中，有报道称受粪便污染的水域常见的细菌粪大肠菌（faecal coliforms）、粪链球菌（faecal streptococc）可能成为溺死的标志的细菌，此研究中发现淡水溺死与海水溺死尸体血液中均发现上述两种细菌的存在［12］。但这两种细菌是否能成为溺死诊断的标志受溺死水域是否被污染及污染的程度影响。

上述细菌无论是在水域中存在或在人体喉部的正常菌群，与藻类相比，细胞体积更小，更容易随溺液进入血液循环分布到脏器中，而可能成为溺死诊断检测对象，对溺死诊断的判断具有积极意义［5］。但上述细菌如喉部正常细菌属于机会致病菌，在某种条件下死者生前血液中可能存在上述细菌，对溺死的判定造成影响。因此，使用上述细菌来诊断溺死前要充分了解死者生前身体健康状况及相关病例来帮助分析是否为溺死是必要的。

2　检验方法

2.1形态学观察

目前，形态学观察主要应用于硅藻检验。对水中尸体脏器进行不同的方法处理后通过离心或滤膜富集的方法收集硅藻，经过光镜或电镜直接观察硅藻的形态与种类来辅助诊断溺死及溺死地点是硅藻检验基本过程。进行硅藻检验的水中尸体脏器处理方法有很多，包括化学消化法（强酸、酶消化组织），物理消化法（灰化法、浸渍法、硅胶梯度离心法、碎浆法等）［2］。其中目前最常用的硅藻检验方法是强酸消化法，但其易污染、灵敏度低［8］。有报道称使用微波消解——真空抽滤——电镜扫描法检测硅藻大大提高了硅藻检验的灵敏度、特异性［8］，但由于仪器昂贵，不易普及。其它藻类如蓝藻、绿藻目前没有相关研究其形态学在溺死诊断中的应用。

2.2培养法

一些研究报道将提取溺死尸体血液进行细菌培养，不同水环境生存的细菌经过不同盐浓度的培养基培养后，其生长状况、生长后菌落的颜色出现差别，从而判断血液中是否含细菌有及细菌种类来判断溺死及溺死地点［6，13，14］。血液中的细菌经过培养提高细菌数量，有利于接下来的相关研究如分子生物学方法检测即可增加PCR扩增时模板量，但此种方法对实验室环境及操作者要求较高，应严格控制污染避免造成假阳性结果。

2.3分子生物学方法

分子生物学方法与传统的硅藻检验方法相比，其优点是无需观察溺死相关生物细胞形态，具有灵敏度高、特异性强等特点［15］。目前，国内外许多研究报道使用分子生物学方法来检测溺死尸体脏器中存在的上述细菌、藻类等生物基因来诊断溺死［3-5，10，16］。相关报道研究方法主要集中在PCR扩增技术与扩增后产物检测方法的不同。

2.3.1PCR技术

PCR扩增技术在溺死诊断的相关研究中，使用PCR扩增技术的类型有以下3种：（1）普通PCR［3，16］；（2）巢式PCR［10］；（3）实时定量PCR［5］。这些溺死诊断相关研究中，PCR技术扩增体系有只含一对引物，有则含有多对引物的复合扩增体系。普通PCR技术是溺死相关研究中最常用的方法，相对简单。巢式PCR技术含有两对引物，据研究称可提高样本阳性率及扩增结果的特异性。实时定量PCR可同步检测原始模板的浓度及产物的量，省去PCR扩增后产物电泳检测的步骤，操作简捷。一对引物的PCR扩增体系与多重PCR技术相比，由于水中尸体腐败导致检测的靶基因降解而使模板量减少可能导致PCR扩增失败引起假阴性结果，而多重PCR技术增加了检测对象的种类或（和）靶基因的数量，可能对于提高溺死诊断的可靠性是一种有效的方法。

2.3.2PCR扩增产物检测方法

PCR扩增后的产物除实时定量PCR技术扩增后无需对产物进行电泳检测，其它PCR技术扩增产物均需电泳检测，常用有琼脂糖-EB电泳、PAGE电泳等。近年有研究将毛细管电泳技术应用到溺死诊断中检测PCR产物，即通过检测不同颜色的荧光的存在来反应检测的产物［17］，这种方法与上述两种电泳技术相比，上样量少，无需制胶、显带等过程，可更加灵敏与迅速完成电泳过程［18］。

2.3.3变性梯度凝胶电泳（DGGE）与变性高效液相色谱分析（DHPLC）检测PCR产物推断溺死地点

判断水中尸体是否为溺死是法医工作中重要的一部分，同时推断溺死地点对法医判断溺死的工作具有重要意义。目前关于溺死地点的推断的分子生物学方法的研究主要有两种方法即变性梯度凝胶电泳（DGGE）与变性高效液相色谱分析（DHPLC）。2008年，何方刚［19］等人将三个不同水域及相应溺死地点实验兔肺脏进行提取浮游生物DNA进行PCR扩增，而后进行DGGE电泳检测，结果显示溺死地点实验兔肺脏与相应溺死水域DGGE图相似而不同于其它水域及溺死兔肺脏。2013年，余政梁［20］等人使用DHPLC法来推断溺死地点，结果同样显示溺死水样与相应溺死兔肺脏DHPLC图谱具有很高相似性。水中尸体溺死的诊断不应仅仅是推断溺死的本身，有时正确推断溺死地点可使溺死诊断更加完整、可靠。

3　小结

溺死诊断是法医病理学工作中常见的任务与困难之一［8］。目前。溺死的诊断主要依靠尸表检查、尸体解剖与实验室检查，尤其当尸体腐败导致溺死征象消失时，实验室检查对溺死诊断更为重要，其中硅藻检查被认为是溺死诊断的不可缺少的手段［2］。但也有报道称非溺死尸体脏器中发现硅藻的存在，其应用也受一些学者的争议［21，22］。近年来，除硅藻外，其它藻类如蓝藻、绿藻等藻类在溺死尸体脏器中被发现，使更多可在溺死尸体脏器中检测到的对象得到丰富。此外，与上述藻类相比，体积更小的一些细菌更容易进入随溺液进入体液循环分布到各脏器中得到证实。若在水中尸体脏器中发现上述藻类与细菌等生物对溺死诊断均具有重要的参考意义。溺死的判定有望随相关研究的深入，会有越来越多可随溺液进入血液循环的生物被发现，增加可检测的对象，联合检测多种对象可使溺死诊断更加可靠。对水中尸体进行溺死诊断外，同时对溺死地点进行确定可使溺死诊断更加完整。目前，我们根据一些研究报道可知DGGE等分子生物学方法可判断溺死地点，但只停留在理论研究中，其应用于实践中的可靠性有待进一步检验。

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广东省科技计划项目（2010A0861001）；公安部科技强警计划项目（2014GABJC020）