PHB合成方法及改性的研究进展*

刘俊梅，王　庆，王　丹，杨盼盼，丁　伟，朴春红，王玉华，于寒松

(1 吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林　长春　130118；2 吉林医药学院，吉林　吉林　132013)



PHB合成方法及改性的研究进展*

刘俊梅1，王庆1，王丹2，杨盼盼1，丁伟1，朴春红1，王玉华1，于寒松1

(1 吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春130118；2 吉林医药学院，吉林吉林132013)

聚-β-羟基丁酸酯(PHB)是一种由细菌胞内合成，作为碳源和能源存储的积累物，可用于合成可降解塑料。并且PHB具有良好的物理可塑性和生物相容性，在现实应用中比较广泛。但由于PHB的生产成本高和过程复杂，并没有普遍进入到人们的生活中。近年来关于PHB的合成方法的研究较多，本研究综述了近年的PHB合成方法：微生物合成法、基因工程法、活性污泥法和化学合成法的研究进展。

PHB；可降解塑料；合成方法

PHA(聚羟基脂肪酸酯)是一种主要由细菌胞内合成，作为碳源和能源存储的积累物，与传统的聚乙烯、聚丙烯等化工材料有相似的物理学特性，而且PHA具有生物相容性以及具有结构多样性，可以完全降解成水和二氧化碳[1]。

而PHB是至今为止PHA家族中研究最多、最彻底的典型成员。早在1926年，法国人Lemoigne从巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)中发现PHB，具有良好的物理可塑性和生物相容性，在食品、医药、环保、农业等领域应用广泛[2]。目前，虽然对微生物发酵生产PHB的产量提高上已经取得了巨大进展，但生产PHB的成本依然成为这个产业的瓶颈。所以人们也在不断采用新的技术手段，尝试多种合成PHB的方法。

1　PHB的合成方法

1.1微生物发酵法

目前，已经发现了许多种类的原核微生物都能产生PHB，包括光能、化能自养和异养菌共计65个属以上的300多种不同的微生物。如：产碱杆菌属(Alcaligenes)、固氮菌属(Azotobacer)、假单胞菌属(Pseudomonas)、生丝微菌属(Hyphomicrobium)、嗜盐杆菌属(Halobacterium)和甲基杆菌属(Methylobacterium)等[3]。PHB的合成现象在自然界中较为普遍，在碳过量、氮限量的控制发酵条件下，PHB在胞内可大量积累。尽管产PHB的微生物种类繁多，但合成PHB的代谢途径主要有三步法合成途径和五步法合成途径：

1.1.1三步合成途径

第一步由相关碳源代谢产生的两个乙酰辅酶A，由基因phbA编码的β-酮基硫解酶(PhbA)催化后产生一个乙酰乙酰辅酶A。第二步由基因phbB编码NADPH依赖的乙酰乙酰辅酶A还原酶(PhaB)，使乙酰乙酰辅酶A还原为(R)-3-羟基丁酰辅酶A(3HB-CoA)。最后由基因phbC编码的PHB聚合酶(PhbC)将3HB-CoA单体聚合成PHB，同时释放游离的辅酶A。这一途径是目前研究最多，并且研究较透彻，在多种细菌中都发现了这条途径。

1.1.2五步合成途径

五步合成途径的第二步反应与三步合成途径不同，由NADH依赖型还原酶将乙酰乙酰辅酶A还原成(s)-3-羟基丁酰辅酶A，再由两个烯酯酰辅酶A水合酶的催化下，分别经过脱水和水合的过程，转变成其异构体(R)-3-羟基丁酞辅酶A，然后在PHB聚合酶的作用下聚合成PHB。

其中真养产碱杆菌具有生长速度快、PHB积累量大、生产技术较为成熟等优点，己经用于工业化小规模生产。吴桂芳发现在限氮培养的条件下有利于PHB的积累，但对细胞生长有一定的抑制作用[4]。张伟等[5]从工厂污水中分离到的北京红篓菌(Rcs.pekingensis strain 3-p)能够以乙酸、琥珀酸和丁酸等为碳源合成PHB。戴君等[6]通过丁醇富集筛选，从土壤样品中筛选到一株假单胞菌SCH17，通过对碳源和氮源的优化，得到最佳积累PHB的碳源是果糖，氮源是蛋白胨。在该培养基中仅需发酵14 h，菌体干重和PHB含量分别达到3.52 g/L和2.69 g/L，PHB含量高达细胞干重的76%。在2013年，董静[7]在富含沼气地区的土壤中培养筛选获得的甲烷氧化混合菌，采用充盈-饥饿模式的好氧动态供料方法，并确立了高产PHB的充盈-饥饿运行条件，在氧气充足的条件下充盈培养5 d，饥饿培养15 d，PHB含量可以达细胞干重的35.5%。发酵法生产PHB在发酵工艺和分离纯化过程中存在因难，产量低，并且成本主要是价格昂贵的培养基。在2014年，Xuerong Han等[8]从淀粉丰富的绿藻中分理处一株产PHB的菌株UMI-21，在以淀粉为碳源时并通过10 L发酵罐合成PHB可达细胞干质量的45.5%，发现这个值比在培养烧瓶中要高。工业上微生物生产PHB的一个主要问题是价格昂贵的培养基，淀粉是一种相对便宜的底物，表明菌株UMI-21在以淀粉为碳源时具有大规模生产的PHB可能性。

1.2基因工程法

1.2.1转基因工程菌法

目前利用重组大肠杆菌合成PHB的方法较成熟，而且大肠杆菌可利用廉价原料和废弃物来大量产生PHB，从而降低生产成本倍受到人们的关注[9]。并且，大肠杆菌缺少降解PHB的关键梅，所以合成的PHB不会被大肠杆菌所降解。大肠杆菌的细胞壁易于破碎，有利于PHB的提取纯化。早在1987年，Dennis成功地从A .eutrophus中克隆到合成PHB的基因，并转入大肠杆菌中，该重组菌株可以直接利用各种碳源作为底物，进一步降低了成本[10]。在2011年，陈泉[11]利用Red同源重组技术敲除了大肠杆菌PTS系统中的关键酶基因-ptsG基因。并成功构建了大肠杆菌DH5aΔptsG/pBHR68，能够同时利用多种糖的混合物高效生产PHB。目前，蛋白质组学也加快了对PHB菌种的代谢研究，产PHB的重组大肠杆菌由于PHB的积累也发生了一定的生理变化。许多变化由于不与PHB合成途径直接相关，而不是非常明显。通过对PHB合成和降解中整个代谢过程的进一步了解可以让我们能设计更好的基因工程菌，并能开发出更有效的发酵方法。

1.2.2转基因植物合成PHB

农作物不仅可以作为食物来源，还可以用来制造大量的化合物，而且它们的价格与同类的石化产品相比较低。淀粉和油脂是目前从植物中提取日用化产品的很好的例子。近年来，分子生物学和植物转化方面的一些项目使植物生产PHB成为可能。目前，已作为PHB合成酶相关基因表达受体生产PHB的植物有拟南芥、甘蔗叶子、棉花和蓝细菌等。John[12]等将phbB及phbC基因与棉花纤维特异启动子串联，然后用粒子轰击法导入棉花植物中。结果表明棉纤维中合成的PHB与细菌合成的PHB相似。在2002年，我国吴桂芳[13]在研究蓝细菌及其基因重组菌产PHB时，采用缺少氮源的条件下激活PHB合成酶基因表达，外加碳源激活PHB合成酶的催化活性，利用葡萄糖及乙酸钠对细胞分阶段培养，得出PHB的产量明显提高。但构建转基因植物产PHB的过程中，在基因组中插入的强启动子和多个PHB合成相关基因后，会产生基因沉默现象，大大降低了PHB的合成效率。在2011年，Ken’ichiro Matsumoto等[14]优化了PHB合成相关基因(PhbB和PhbC)的密码子，以改善其在植物中的mRNA的翻译效率。结果表明在转化体内PHB的含量平均为0.2 mg/g干细胞重，比携有野生型基因(PhbB和PhbC)所产的PHB的0.09 mg/g干细胞重高。但已有结果表明PHB积累会抑制植物生长，植物到生长后期PHB的积累能力会明显下降，目前转基因合成PHB依然没有大规模应用[15]。

1.3活性污泥法

活性污泥包含多种混合的微生物群落，在污泥中，微生物对食物的竞争是非常激烈的，并且生长环境也很恶劣，其中的PHA的积累通常是被微生物作为一种抗逆机制存在的。与PHA合成相关的研究比较多的一个活性污泥处理过程是高效生物除磷处理过程(EBPR)。近年来新兴的活性污泥法合成PHB技术不仅能有效去除污水中氮、磷等污染物，并且能够回收污泥中PHB[16]。早在20世纪80年代，人们就开始认识到PHB是EBPR活性污泥处理过程中的一个很重要的代谢物。研究学者们发现活性污泥中的好氧菌如：黄杆菌属、产碱杆菌属、贝氏硫菌和动胶菌属等，都能在苏丹黑染色后在显微镜下发现PHB颗粒[17]。黄晓钰等[18-19]利用工厂的污泥好氧发酵生产PHB，分两阶段培养污泥，第一阶段提供适合的条件，筛选出适合污泥生长的培养基。第二阶段筛选发酵培养基进行发酵生产PHB，PHB的累积量达污泥浓度(MLSS)的4.86%。在2009年，德吉央宗[20]采用乙酸钠为碳源，通过好氧动态供料法在序批式活性污泥法(SBR)反应器中对活性污泥进行驯化，结果表明在一定范围内，随着溶解氧浓度的提高、碳源浓度升高，PHB合成量也逐渐增加。在缺氮条件下，PHB的最大积累量达1598 mg/L，占质量分数的65.2%。而营养平衡时的最大累积量仅为 784.6 mg/L，占质量分数的 45.4%。在2013年，Laetitia Cavaille等[21]以乙酸作为底物，在好氧分批补料的条件下研究废物活化污泥(WAS)产PHB的特点。发现通过调节来源不同的活性污泥中磷元素浓度，的可以诱导活性污泥中PHB的积累。目前，由于活性污泥环境中成分复杂，从而导致下游的分离成本高，这也限制了用活性污泥的方法生产PHB。也正是因为活性污泥环境的复杂，微生物种类的繁多，我们可以在活性污泥中获得许多PHA合成的相关基因，具有获得许多新型PHA的潜力。

1.4化学合成法

用微生物发酵法生产PHB，其复杂的工艺流程和严格的条件，决定了其生产成本高、生产周期长、产量低，萃取和纯化操作难度大，严重阻碍了其工业化应用。因此，化学法合成PHB作为开发生产PHB的另一途径。化学法合成PHB目前主要存在三种方法：一种是以β-丁内酯为单体制备PHB，一种以3-羟基丁酸为单体制备PHB，另一种是以β-羟基丁酸乙酯为单体聚合PHB。早在1993年，Hori等[22]采用锡烷络合物作为催化剂，利用β-丁内酯可制得PHB，其性质与生物发酵制得的产品类似。Seebach等[23]提出了以3-羟基丁酸为原料，在用本体聚合制备PHB。在2005年，我国王佳宁等[24]采用3-羟基丁酸乙酯本体聚合制备PHB，以钛酸四丁酯为催化剂，在一定压力下，反应时间为30 h，聚合物的聚合度可达到75.3。采用化学法合成PHB，虽然可以提高PHB的产量，降低生产成本。但是化学法合成PHB，使用的原料一般都比较昂贵，而且大部分有毒性，化学反应条件严苟，伴随的副反应较多，反应回收率较低，反应的产物分离困，还会对环境造成二次污染，这些都是阻碍化学合成PHB要面临的问题。

2　展　望

目前石油化工类高分子塑料已经成为人类不可缺少材料，其主要原因是这类材料具有成本低，结构多样，应用广泛等特点。但其负面效应也随之而来，由于化工类塑料在自然界中很难降解，形成了白色垃圾严重污染了我们的生存环境。因此，人们急需寻找一种能代替石油化工类塑料的可降解材料。而PHB是至今为止PHA家族中研究最彻底的典型成员，PHB具有良好的生物相容性和生物降解性。对于PHB合成的研究将会加快生物可降解塑料的研究和开发，并具有非常广阔的前景。

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Research Progress on Synthesis and Modification of PHB*

LIU Jun-mei1, WANG Qing1, WANG Dan2, YANG Pan-pan1, DING Wei1,PIAOChun-hong1,WANGYu-hua1,YUHan-song1

(1 College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Jilin Changchun 130118;2 Jilin Medical College, Jilin Jilin 132013, China)

Poly-β-hydroxybutyrate (PHB) belongs to a bacterial cell by a synthetic substance as accumulated carbon and energy storage. It can be used for the synthesis of biodegradable plastics. PHB has good physical plasticity and biocompatibility, applies more widely in real-world. However, due to the high cost of production of PHB and the complex process, PHB is no universal access to people’s lives. In recent years, studies on the synthesis of PHB attract more attentions, synthetic methods of PHB were reviewed such as microbial synthesis, genetic engineering, activated sludge and chemical synthesis method.

PHB; biodegradable plastics; synthesis method

吉林省科技支撑重大攻关专项(项目编号：20116034)。

刘俊梅(1973-)，女，博士，副教授，研究方向食品生物化学与功能食品。

TQ050.4

A

1001-9677(2016)01-0016-03