THZ时域光谱技术在生物DNA鉴定中的应用

王 芳，蔡 蒙，刘云飞



THZ时域光谱技术在生物DNA鉴定中的应用

王 芳1,2，蔡 蒙2，刘云飞1

（1. 南京林业大学，江苏 南京 210037；2. 三江学院，江苏 南京 210012)

利用太赫兹时域光谱技术研究了松材线虫、拟松材线虫、鲱鱼、鲑鱼和白杨等不同DNA分子的吸收光谱，分析发现：随着样品厚度的减少，吸收峰会发生简并现象；折射率也会随着样品厚的增加而增加。通过比较不同DNA分子的吸收谱还发现：相似物种DNA分子比不同物种具有更多重合的吸收峰，推测这跟DNA分子内碱基排序有关。在DNA检测方面，傅里叶红外光谱仪和太赫兹光谱仪配合使用，可以从光谱的宽度和精度上互补，发挥更大优势。最后得到几种不同DNA分子所有吸收峰位置，这为今后建立DNA太赫兹光谱数据库和鉴别DNA大分子奠定基础。

吸收频率；折射率；DNA；太赫兹时域光谱技术

0 引言

太赫兹（THz）辐射是位于0.1～10THz频率范围的红外电磁光谱。大量实验表明，太赫兹辐射不会对基因组造成伤害[1]。太赫兹波段的吸收光谱反映了低频率的分子内部运动，这是依赖于双螺旋碱基对的弱氢键[2]。近年来，研究DNA（脱氧核糖核酸）光谱的文章有很多，但大部分都位于近红外、中红外和部分远红外的范围[3]。D. L. Woolard等人[4]研究了10～25cm－1（0.3～0.75THz）频率范围内鲱鱼和鲑鱼的DNA透射谱，发现了许多相同和不同的声子模式，然而，并没有详细研究吸收峰与内部结构之间的关系。BM Fischer等人[5]通过密度泛函理论（density functional theory，DFT）对胸腺嘧啶的四聚体单元进行计算，获得的4个低频红外活性振动模式均来源于这两组氢键面内振动和面外振动的分子间运动。

本文利用THz时域光谱技术研究了松材线虫（，简称Bx），拟松材线虫（，简称Bm），鲱鱼（herring），鲑鱼（salmon），白杨（aspen）等5种不同DNA样品的透射谱。Bx是一种外来入侵物种，可对松树带来巨大灾难，Bm是一种生活在健康松树上的无害昆虫，Bx和Bm在外形上看不出任何差别，它们同属于线虫科；鲱鱼和鲑鱼属于脊索动物门，白杨是植物。本文利用太赫兹光谱仪（有效频率范围0.5～2.5THz）和傅里叶红外光谱仪（有效频率范围1～9THz），分别得到5种DNA样品的吸收谱，并比较了不同样品、不同纯度样品以及不同厚度样品的吸收系数和折射率。

1 实验准备与实验原理

1.1 实验仪器

测试DNA分子采用的是日本ADVANTEST公司tas7500系列太赫兹光谱仪和傅里叶红外光谱仪，可获得低能量下，包括分子间相互作用的光谱信息，由此来分析晶体化合物的属性[6]。图1(a)显示了太赫兹脉冲通过背景（聚乙烯粉末）和样品（脱氧核糖核酸）前后的时域谱，图1(b)是其对应的功率谱。

图1 THz脉冲通过Bm-DNA前后的时域谱和对应的功率谱

1.2 样品制备和实验准备

实验中用到的鲱鱼和鲑鱼DNA样品购于西格玛公司。鲱鱼样品为纯度高于90%的冻干粉，可直接与PET（Polyethylene，聚乙烯）粉末均匀混合压片测试；鲑鱼样品为纯度高于90%的絮状物，需用蒸馏水充分溶解后与PET粉末混合搅拌均匀，放入60℃的烘箱烘干，研磨均匀后压片测试。实验中用到的松材线虫、拟松材线虫和白杨DNA样品为实验室自行提取，样品为液体，需与一定量的PET粉末均匀混合后，放入烘箱60℃烘干，研磨均匀后压片测试。

1.3 样品厚度计算

为了测出样品厚度对光谱的影响，实验中需要制备不同厚度的样品，具体方法如下：

假设需要制备的样品厚度为，样品由2种纯净物（A和B）组成，混合物中A和B的比例为1:2，需要通过计算得到混合物中所需A和B的质量。过程如下：

1）准备一个精度为万分之一克的天平，分别称取一定质量的纯样品A和B，质量记为1和2克；

2）给压片机施加2kN的压力将样品压成表面光滑，厚度均匀的薄片；

3）用精度为千分之一毫米的测厚仪测出纯样品A和B的厚度分别为1和2；

4）利用公式：

计算出纯样品A和B的密度分别为1和1，其中为第一步称取样品的质量，为第三步测量样品的厚度，为样品半径（该参数固定为13mm）；

5）利用公式：

计算出厚度为的样品所需纯样品A和B的质量分别为1和2：

6）根据第五步计算出的质量称取纯样品A和B，混合均匀后压成厚度均匀的薄片；

7）利用测厚仪测量样品厚度对结果进行校验。经过反复多次测试，误差均在5%范围以内，随着样品厚度的增加精度也相应的提高。

1.4 吸收系数和折射率的计算

为了找到样品特征，需要原始时域数据计算出样品的折射率，吸收系数和透光率。其中，样品的原始时域数据通过光谱仪测得，为了减小基线偏移，将获得的原始时域数据减去原始时域数据的平均值，得到样品的功率谱如下：

假设s()和r()分别是样品和背景的对数谱，样品的透光谱可以被表示为：

Transmittance(log)＝s()－r() (8)

Transmittance(%)＝10(Transmittance(log)/10)×100 (9)

最后，得到样品的吸收系数和折射率：

式中：是样品厚度，cm；e是自然对数；是光速；()是样品和参考的相位差。

2 实验结果与讨论

2.1 不同纯度和厚度样品的光谱研究

利用太赫兹光谱仪测试了不同厚度鲱鱼DNA样品的折射率和吸收系数。经过多次实验，发现空气，样品和的聚乙烯在0.1～0.5THz频率范围的吸收谱非常相似，如图2(a)所示，推测是由仪器灵敏度低造成的。图2(b)为0.5～2.5THz光谱范围内，利用太赫兹光谱仪测得的不同厚度（0.3mm，0.47mm，1.07mm）鲱鱼DNA样品的吸收系数，图2(c)为1～9THz光谱范围内，利用傅里叶红外光谱仪测得的不同厚度（0.5mm，1mm）鲱鱼DNA样品的吸收系数。由于样品吸收曲线的基线不同，很难比较不同样品的吸收特性。因此，对吸收曲线九点平滑后求其二阶导数再取反，从图2(d)可以发现吸收特征更加明显且吸收峰的位置与图2(a)相比并无变化。分析还发现，随着样品厚度的减小，吸收峰发生简并现象，这不同于D.L.Woolard[4]等人的研究，D.L.Woolard等人认为样品吸收与样品厚度无明显关系，他们研究的样品厚度均小于220mm，但在这里，样品厚度超过了500mm。

图2 不同厚度样品的太赫兹光谱比较

本文还比较了不同纯度鲑鱼DNA样品的太赫兹光谱，图3(a)给出了0.5～2.5THz光谱范围内不同纯度的鲑鱼DNA样品吸收系数的二阶导数取反，比较发现，纯样品因为吸收太强烈，吸收峰的位置和强度与混合了聚乙烯的样品有很大区别，反复测试发现，20%～50%纯度的鲑鱼DNA样品的吸收峰是最好辩认的，纯度低于10%会导致吸收峰太弱难以检测。样品的最佳纯度取决于样品本身，要通过反复实验获得。利用公式(11)，计算出不同厚度的鲱鱼DNA样品的折射率，如图3(b)所示，随着样品厚度的增加，折射率也在相应的增加。折射率是物质的固有属性，在理论上并不随着样品厚度的改变而改变，但应该注意的是，理论和实验数据有一定的误差，而这种误差与厚度成正比[7]。所以，只有当样品的厚度相同时，比较不同样品的折射率才有意义。

2.2 不同DNA样品太赫兹光谱比较

测试了0.5～2.5THz范围内5种不同DNA样品的太赫兹光谱。发现，松材线虫和拟松材线虫DNA，鲱鱼和鲑鱼DNA有许多相同的声子模式，如图4所示，松材线虫和拟松材线虫DNA有22个共同的吸收峰和14个特有的吸收峰（松材线虫10个，拟松材线虫4个），鲱鱼和鲑鱼DNA有22个共同的吸收峰和20个特有的吸收峰（鲱鱼8个，鲑鱼12个）。

图3 不同纯度样品太赫兹光谱比较以及不同厚度样品折射率比较

图4 同源物种DNA太赫兹光谱比较

Fig.4 Terahertz spectrum of the similar species DNA

还比较了不同物种的DNA吸收光谱，发现动物（鲱鱼）DNA和植物（白杨）DNA在0.5～2.5THz范围内大约有13个相同的吸收峰和24个特有的吸收峰（鲱鱼16个，白杨8个），如图5所示。说明同源的物种较不同物种有更多相同的吸收峰。所以我们推断太赫兹时域光谱（THz-TDS）技术是识别不同物质DNA的一个有效工具。但是，由于吸收峰的位置太多，目前无法分辨出特征峰的位置。

图5 0.5～2.5THz光谱范围内鲱鱼和白杨DNA样品吸收系数的二阶导数取反

2.3 不同DNA样品傅里叶红外光谱比较

利用傅里叶红外光谱仪并配合不同波长的分束器（6mm、25mm、50mm），得到了不同DNA样品的吸收谱，发现当分束器波长大于50mm时，得到的吸收谱近似于太赫兹光谱仪测得的结果，故在此省略介绍。图6(a)为利用6mm分束器，得到的0.5mm鲱鱼DNA样品的红外吸收谱。图6(b)为利用25mm分束器，得到的0.5mm鲱鱼DNA样品红外吸收谱。图6(c)为利用6mm分束器，得到的0.5mm松材线虫和拟松材线虫DNA样品红外吸收谱。

比较发现，不同于太赫兹光谱仪测得的结果，利用6mm分束器，傅里叶红外光谱仪可以清晰的测得不同DNA样品的特征峰位置和光谱形状。从图6(c)可以看出，相似物种DNA样品吸收谱形状和吸收峰位置都比较接近，只存在一些细小的区别，如弱吸收峰位置、吸收强度、吸收峰宽度，这说明相似物种DNA分子中绝大部分碱基排列一致。比较图6(a)和6(c)发现，不同物种DNA样品吸收光谱形状和吸收峰位置存在很大差别。所以，利用吸收谱的形状和吸收峰的位置可以对不同物种DNA作出快速鉴别。

经过多次重复测试，得到几种DNA样品的特征峰位置，为将来建立DNA分子光谱数据库奠定基础。如：鲱鱼在3.09THz有一个较强的吸收峰，在5.6THz有一个非常强且很宽的吸收包络，在7.3THz有一个弱吸收峰；拟松材线虫和松材线虫在5.3THz均有一个非常强的吸收峰，在3.8THz和7.3THz存在弱吸收峰，在3.3THz存在一个共同的吸收谷，但是在5.3THz处吸收峰的宽度和强度不一样，这可以为鉴别拟松材线虫和松材线虫提供依据。从图6(a)和6(c)我们还作出一个大胆的推测，5.3THz处的弱吸收峰是鲱鱼、松材线虫、拟松材线虫DNA分子的共同特征造成的。为了进一步找出每种DNA样品的特征峰位置，为DNA快速无损检测奠定基础，今后我们的研究内容包括：测试更多的样品找出DNA分子吸收谱的规律，从碱基、碱基对、DNA片段开始深入研究，并结合Gaussian、Amber等软件，利用分子动力学理论对吸收谱作出解释，给实验数据提供支撑。

图6 不同DNA样品的傅里叶红外光谱

3 结论

经过反复实验，结合太赫兹时域光谱技术，利用太赫兹光谱仪和傅里叶红外光谱仪，得到松材线虫、拟松材线虫、鲱鱼、鲑鱼和白杨等5种不同物质DNA（脱氧核糖核酸）的太赫兹光谱，找到了这些DNA大分子的吸收峰位置，这为以后建立DNA数据库和DNA鉴定提供了一种新的方法。研究结果表明：在DNA光谱研究方面，傅里叶红外光谱仪能更清楚地获得DNA分子吸收谱形状和特征峰位置，同源物种的吸收谱拥有相似的形状和更多相同的吸收峰位置，只是在弱吸收峰位置、吸收峰宽度和强度上存在细小区别。可惜的是，研究只是发现了这些物质的吸收峰位置，并不能确定这些特征频率对应的声子模式，还需要借助分子动力学模型来对基因结构进一步确定。此外，还比较了不同厚度鲱鱼DNA样品的吸收系数和折射率，结果表明：随着样品厚度的减少，吸收峰出现简并现象，折射率也会随着样品厚度的增加而增加。研究还发现，样品的吸收峰的位置和强度与样品纯度有很大关系，需要反复实验，才能找到最佳测试样品的厚度。

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Application of THZ Time Domain Spectroscopy Technologyin Creature DNA Identification

WANG Fang1,2，CAI Meng2，LIU Yunfei1

(1.,210037,; 2.,210012,)

In this paper, the transmission spectral characteristics of Bx-DNA, Bm-DNA, herring-DNA, salmon-DNA and aspen-DNA have been studied by terahertz-time domain spectroscopy (THz-TDS) in the frequency range of 0.5-2.5THz. The absorption peaks have the phenomenon of merger when the thickness of the samples decrease, and the refractive index increases as the thickness of the samples increasing. By comparing with the absorption coefficient of different kinds of DNA molecules, we have found that the homologous species have more same absorption peaks than different species. In the detection of DNA, use of Fourier infrared spectrometer and terahertz spectrometer can obtain the accuracy and width of the spectra simultaneously. We also have picked up different DNA samples of which absorption peaks are in the frequency range of 0.5-2.5 THz in the experiments and we want to establish the database of DNA terahertz spectroscopy and identify the DNA macromolecules.

absorption frequency，refractive index，DNA，THz-TDS

O433

A

1001-8891(2016)04-0342-06

2015-10-01；

2016-03-10.

王芳（1984-），女，汉，江苏盐城人，博士研究生，讲师，研究方向为无损检测技术。

国家自然科学基金（31170668和31200541）；江苏省自然科学基金（BK2012417）；江苏省高等教育机构优势学科项目（PAPD）。