重组人白细胞介素-11对肺腺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭的影响

肖荣，康马飞，骆梅青，董翠梅，刘秀丽



重组人白细胞介素-11对肺腺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭的影响

肖荣，康马飞△，骆梅青，董翠梅，刘秀丽

摘要:目的观察重组人白细胞介素-11（rhIL-11）对肺腺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭的影响，并初步探讨其影响机制。方法分别以0、10、20、50、100 μg/L终浓度的rhIL-11作用于A549细胞，MTT法测定A549细胞增殖程度；用0、10、40、80 μg/L终浓度的rhIL-11作用于A549细胞，划痕实验和Transwell侵袭实验测定A549细胞的迁移和侵袭能力；Western blot检测基质金属蛋白酶（MMP）-2和MMP-9蛋白水平的表达。结果rhIL-11对A549细胞增殖能力无影响；rhIL-11作用于A549细胞后，细胞的迁移和侵袭能力显著增强；rhIL-11能显著上调MMP-2和MMP-9的表达，且表达随rhIL-11浓度的增高而增高（P < 0.05）。结论rhIL-11能够促进A549细胞的迁移和侵袭，促进MMP-2、MMP-9上调为其可能的机制之一。

关键词：白细胞介素11；癌,非小细胞肺；细胞迁移分析；肿瘤侵润；基质金属蛋白酶2；基质金属蛋白酶9；重组人白细胞介素11

白细胞介素（IL）-11属于IL -6因子家族，是一种由人骨髓基质细胞及间质细胞分泌的多功能细胞因子。重组人白细胞介素11（rhIL-11）因参与调控血小板的生成而被临床用于治疗各种原因引起的血小板减少症，尤其是放化疗后的血小板减少。然而，研究发现，rhIL-11对胃癌细胞的侵袭和迁移能力有促进作用[1]。但rhIL-11对A549肺腺癌细胞的增殖、迁移与侵袭能力的影响尚鲜见报道。本研究旨在观察rhIL-11对人肺腺癌细胞株A549细胞增殖、迁移与侵袭能力的影响，并对其可能的机制进行探讨。

1　材料与方法

1.1主要材料与试剂人非小细胞肺腺癌细胞株A549购自中科院上海细胞保藏中心。细胞培养基购自美国GIBICO公司。胎牛血清购自Hyclone。细胞培养板购自广州杰特生物公司。Transwell小室购自美国BD公司。兔源GAPDH抗体、基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9抗体购自万类生物公司。羊抗兔二抗购自北京中杉金桥有限公司。rhIL-11由齐鲁制药有限公司生产。

1.2细胞培养人肺腺癌A549细胞培养于含10%的胎牛血清PRMI1640培养液中，置于37℃，5%CO2饱和湿度环境中培养。

1.3MTT法检测rhIL-11对A549细胞增殖的影响取对数生长期A549细胞，制成1.75×104/mL的细胞悬液，每孔3 500个接种于96孔板，次日加入不同浓度的rhIL-11，终浓度分别为10、20、50、100 μg/L，对照组正常培养，每组设6个平行孔，37℃培养24、48、72h。以MTT法检测细胞增殖水平。

1.4划痕实验检测rhIL-11对A549细胞迁移能力的影响用Marker笔在6孔板背后标记6条Marker线。取对数生长期A549细胞接种到6孔板中，每孔接约15×104个细胞，放入37℃，5%CO2培养箱培养，24h后细胞铺满开始划痕实验。用灭菌的200 μL黄色枪头在每个孔中间划一条痕，PBS洗2遍，去除划下的细胞，用正置显微镜拍照。换不同浓度的rhIL-11（10、40、80 μg /L）无血清培养液继续培养，对照组用无血清培养基代替药物，每组设3个平行。24h后显微镜拍照，对应Marker线测量划痕距离。用Photoshop中的直方图测量间距大小，表示不同组细胞发生迁移的距离。将对照组迁移距离大小设为100%，实验组迁移比例为：（实验组迁移距离-对照组迁移距离）/对照组迁移距离×100%。数据分析后作图。

1.5Transwell实验检测rhIL-11对A549细胞侵袭能力的影响取对数生长期的细胞。终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1～2遍，再用无血清培养基重悬，彻底去除血清干扰，调整细胞密度1×105个。在孔径为8 μm Transwell小室里加入制备好的细胞悬液，同时加入不同浓度的rhIL-11（10、40、80 μg /L）处理，小室内液体总体积为200 μL。24孔板中加入500 μL含10%胎牛血清的完全培养基。将Transwell小室放入24孔板中。将带有小室的24孔板置于37℃，5%CO2培养箱中培养，24h后取出，固定，0.1%结晶紫染色，正置显微镜100倍镜下拍照，数据分析后作图。

1.6Western blot检测MMP-2、MMP-9表达水平A549细胞用不同浓度的rhIL-11（0、10、40、80 μg /L）处理24h后，用PBS洗3次，收集细胞并抽提蛋白，12 000 r/min，4℃离心20min，取上清蛋白液，用BCA蛋白定量试剂盒定量。取25 μg蛋白加入5×SDS-PAGE上样缓冲液，100℃煮沸10min，10% SDS-PAGE电泳分离，260mA转膜90min，5%牛奶室温封闭1h，TBST洗膜5min×6次，加入MMP-2（1∶500），MMP-9（1∶500）一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜5min×6次，加HPR标记二抗（1∶5 000）室温1h，TBST洗膜5min×6次。以GAPDH为内参对照，实验重复3次。

1.7统计学方法使用SPSS 18.0软件完成统计学分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析及重复测量资料的方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1rhIl-11对A549细胞增殖的作用不同浓度、不同时间的rhIL-11组处理后均对A549细胞增殖无明显影响，差异无统计学意义，见表1。

Tab.1　Effects of different times and different concentrations of rhIL-11 on proliferation of A549 cells表1　不同浓度rhIL-11作用不同时间对A549细胞增殖的影响　（n=6，±s）

Tab.1　Effects of different times and different concentrations of rhIL-11 on proliferation of A549 cells表1　不同浓度rhIL-11作用不同时间对A549细胞增殖的影响　（n=6，±s）

F分组=1.151，F时间=3.243，F交互=2.469，均P>0.05

组别0 μg/L 10 μg/L 20 μg/L 50 μg/L 100 μg/L 24h 0.48±0.01 0.49±0.01 0.50±0.01 0.51±0.00 0.51±0.01 48h 0.65±0.01 0.64±0.01 0.63±0.02 0.69±0.01 0.71±0.00 72h 0.85±0.01 0.84±0.01 0.82±0.02 0.80±0.00 0.79±0.00

2.2rhIL-11对A549迁移及侵袭能力有促进作用

2.2.1划痕实验细胞划痕后，用不同浓度0、10、40、80 μg/L rhIL-11处理A549细胞24h后，100倍倒置显微镜镜下观察细胞划痕愈合情况，见图1。不同浓度rhIL-11作用24h后A549细胞的迁移率明显上升（P < 0.05），见表2。

a、b、c、d分别表示rhIL-11浓度为0、10、40、80 μg/L；上、下图分别为不同浓度的rhIL-11作用0、24hFig.1　Effects of different concentrations of rhIL-11 onmigration of A549 cells（×100）图1　不同浓度rhIL-11对A549细胞迁移能力的影响（×100）

Tab.2　Effects of different concentrations of rhIL-11 on invasion of A549 cells表2　不同浓度rhIL-11对A549细胞迁移及侵袭能力的影响　（n=6，±s）

Tab.2　Effects of different concentrations of rhIL-11 on invasion of A549 cells表2　不同浓度rhIL-11对A549细胞迁移及侵袭能力的影响　（n=6，±s）

＊＊P < 0.01；a与（1）组比较，b与（2）组比较，c与（3）组比较，P < 0.05；表3同

组别0 μg/L组（1）10 μg/L组（2）40 μg/L组（3）80 μg/L组（4）F细胞迁移率（%）19.94±0.44 24.83±0.54a35.91±0.61ab56.71±0.75abc60.453＊＊侵袭细胞数（个）117.75±15.71 164.39±13.14a192.83±17.44ab293.62±3.13abc236.961＊＊

2.2.2Transwell侵袭实验A549细胞在Transwell小室内经不同浓度rhIL-11处理24h后，侵袭能力明显增强，并呈现浓度依赖性（P<0.05），见表2、图2。

Fig.2　Effects of different concentrations of rhIL-11 on invasion of A549 cells图2　不同浓度rhIL-11对A549细胞侵袭能力的影响（结晶紫，×100）

2.3rhIL-11对侵袭相关蛋白表达的影响经不同浓度rhIL-11作用24h后，A549细胞MMP-9和MMP-2表达均上调，且呈现浓度依赖性（P＜0.05），见表3、图3。

3　讨论

IL-11是细胞因子IL-6家族中的一员，与IL-6共用GP130信号转导受体亚单位[2]，是骨髓基质细胞分泌的一种多功能造血调控因子，对造血细胞尤其是巨核细胞具有重要的调控作用，对神经细胞、脂肪细胞及小肠腺窝绒毛干细胞等非造血细胞亦具有明显的生物活性，在骨髓造血调控中发挥重要作用。有研究证明，外源性IL-11可有效地促进各种原因所致血小板减少症的恢复[3-4]。然而，近期研究显示，IL-11过表达与肿瘤的发生发展和转移有关[5-7]。

Tab.3　Effects of different concentrations of rhIL-11 on expressions ofmMP-9 andmMP-2 of A549 cells表3　不同浓度rhIL-11对A549细胞MMP-9和MMP-2表达的影响　（n=6,%,±s）

Tab.3　Effects of different concentrations of rhIL-11 on expressions ofmMP-9 andmMP-2 of A549 cells表3　不同浓度rhIL-11对A549细胞MMP-9和MMP-2表达的影响　（n=6,%,±s）

组别0 μg/L组（1）10 μg/L组（2）40 μg/L组（3）80 μg/L组（4）FmMP-9 24.12±0.00 38.54±0.00a43.71±0.01ab53.04±0.00abc55.471＊＊MMP-2 13.63±0.00 18.92±0.00a24.32±0.00ab28.92±0.00abc28.567＊＊

Fig.3　Effects of different concentrations of rhIL-11 on expressions ofmMP-9 andmMP-2 of A549 cells图3　不同浓度rhIL-11对A549细胞MMP-9和MMP-2表达的影响

有研究者发现外源性IL-11对胃癌细胞并无明显促增殖作用，但对肿瘤细胞的增殖能力可能有潜在的促进作用[8]。本研究结果则发现rhIL-11对A549细胞的增殖能力无明显影响。此结果与上述研究结果不符，是否与瘤种不同有关，或者与长时间、高浓度的rhIL-11作用有关，有待于进一步研究证实。本研究结果表明，外源性IL-11对A549细胞的迁移和侵袭能力有促进作用，这一作用亦在分子水平上得以证实，在外源性IL-11的作用下，与肿瘤细胞侵袭转移相关的MMP-2和MMP-9蛋白表达量增加，并呈现一定的浓度依赖效应。MMP-2 和MMP-9是降解Ⅳ型胶原最主要的酶，Ⅳ型胶原酶对肿瘤细胞向外扩散和转移极为重要。国内外实验研究结果证实，MMP-2和MMP-9与肺癌的发生、发展、浸润、转移和预后密切相关[9-10]。肿瘤侵袭和转移的机制非常复杂，可能通过多条通路实现，很多与肿瘤侵袭和转移有关的通路的激活都涉及到MMP-2和MMP-9的异常表达[11-12]。另外，在很多研究中，抑制MMP-2和MMP-9的表达可明显抑制肿瘤的侵袭和转移[13- 15]。本研究显示rhIL-11对MMP-2和MMP-9的蛋白表达有显著的上调作用，提示外源性IL-11对肺癌A549细胞的侵袭和迁移能力有显著的增强作用。

本研究结果显示，外源性IL-11对A549细胞的迁移和侵袭能力有显著的促进作用。但临床上使用rhIL-11是否促使肿瘤浸润转移，有待于临床随机对照研究证实。

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（2015-06-24收稿2015-09-17修回）

（本文编辑李国琪）

Effects of recombinanthuman interleukin 11(rhIL-11) on proliferation,migration and invasion of pulmonary adenocarcinoma A549 cells

XIAO Rong, KANGmafei△, LUOmeiqing, DONG Cuimei, LIU Xiuli
Department ofmedical Oncology, the Affiliatedhospital of Guilinmedical College, Guilin 541001, China
△Corresponding Author E-mail: kmfgl@163.com

Abstract:Objective To observe the effects of recombinanthuman interleukin 11(rhIL-11) on proliferation,migration and invasion of A549 cells, and themechanism thereof.Methods Final concentrations of 0, 10, 20, 50 and 100 μg/L rhIL-11 were added into pulmonary adenocarcinoma A549 cells.The cell proliferation was detected bymTT.The wound-healing, transwellmigration assay were used to validate the capability of themigration and invasion of A549 cells.Matrixmetallopro⁃teinases (MMP)-2 andmMP-9 protein expressions were revealed by Western blot assay.Results The proliferation of A549 cells was not significantly changed by rhIL-11.The cell capability tomigrate and invade was significantly increased 24h af⁃ter treatment with rhIL-11 (P < 0.05).The expression levels ofmMP-2 andmMP-9 were significantly un-regulated, and which were increased with the increased concentrations of rhIL-11 (P < 0.05).ConclusionrhIL-11 can promote themigra⁃tion and invasion of A549 cells, and the up-regulation ofmMP-2 andmMP-9 expressionmight be one of themechanisms.

Key words:interleukin-11; carcinoma, non-small-cell lung; cellmigration assays; neoplasm invasiveness;matrixme⁃talloproteinase 2;matrixmetalloproteinase 9; rhIL-11

通讯作者△E-mail:kmfgl@163.com

作者简介：肖荣（1990），女，硕士研究生，主要从事肿瘤的基础与临床研究

基金项目：桂林市科技攻关项目（20150126-1-2）

中图分类号：R734.2

文献标志码：A

DOI:10.11958/51942

作者单位：桂林医学院附属医院肿瘤内科（邮编541001）