失重对细菌的影响及机制研究进展

容 丹， 王佳平， 高建义， 李勇枝

(中国航天员科研训练中心，北京 100094)

失重对细菌的影响及机制研究进展

容 丹， 王佳平， 高建义， 李勇枝*

(中国航天员科研训练中心，北京 100094)

失重是主要空间环境因素之一，人体及航天器会携带细菌到太空。失重会造成沙门氏菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌等表型改变，出现增殖、毒力、生物被膜和环境抵抗力等方面的改变。而且，失重会引起人体免疫力下降，被细菌感染机会增加。文章就失重对细菌的影响及机制进行综述，以期能为相关研究提供新思路。

失重；细菌；毒力；生物被膜

航天飞行中的生物医学问题一直是空间科学研究的重点，空间微生物对航天员及航天器的影响是其中较为棘手的难题。在人体的皮肤、呼吸道、消化道都寄生着许多细菌。大量研究已经表明太空环境会造成部分细菌增殖加快、对极端环境和抗生素的抵抗力增加以及毒性增强等[1-3]，并且太空环境中的密闭环境、失重、辐射等空间因素会造成航天员免疫力下降[4-5]，致使航天员患上感染性疾病的几率大大增加。文章针对空间常见细菌，综述了失重对其影响的研究进展，以期能为下一步的研究提供思路｀。

1 失重对细菌增殖的影响及机制

研究表明，失重会促进细菌的增殖。Vukanti等[2]对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌进行研究，对比模拟失重和正常重力对不同营养浓度下培养的细菌影响发现，在营养缺失组，金黄色葡萄球菌在失重条件下生长率显著高于正常重力；失重下两种细菌的产量显著高于正常重力；此外，两种细菌的平均膜电位和细胞膜完整性在模拟失重条件下都更高，这与细胞的生理活性相关，如三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate,ATP)合成、营养物质转运等，推测这与两种细菌在失重条件下增殖加快直接相关。Arunasri等[6]对大肠埃希菌进行进一步研究发现，在模拟失重环境下生长的菌株，基因芯片结果发现53个基因表达上调，47个基因表达下调，查询京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes,KEGG)发现，14个下调基因和1个上调基因能在信号通路中体现，15个基因分属于16条与代谢相关的信号通路，推测模拟失重可能通过促进细胞代谢来促进细菌增殖。

类似现象也出现在其他菌种当中，Kim等[7]在亚特兰蒂斯STS-135任务期间搭载铜绿假单胞菌进行研究，在低氧低浓度磷酸盐培养基中，搭载组最终的细胞密度是地面组的1.5倍；而当氧气和磷酸盐浓度增加时，搭载组最终细胞密度和地面组无显著差异，提示在营养缺乏的环境中，失重对铜绿假单胞菌增殖的影响更为明显。针对沙门氏菌的研究也得出类似结论[8]，在模拟失重条件下，通过分光光度计检测菌密度，发现沙门氏菌的生长速率显著加快,通过菌落形成单位(Colony-Forming Units,CFU)计数发现，细菌的增代时间明显减少，由1.84 h减至1.4 h，实验在野生型沙门氏菌和rpos基因缺失株上都得出相同结果，提示失重加快沙门氏菌增殖与环境压力调节基因rops无关。Mauclaire 等[9]把在国际空间站中分离得到的藤黄微球菌进行模拟失重对照研究，结果显示模拟失重组藤黄微球菌菌量均较对照组增多。针对肠出血型大肠埃希菌(EnterohemorrhagicEscherichiacoli,EHEC)的研究[10]也证实模拟失重会使EHEC生物量增高，但在此研究中生物量的增高更多的是依赖细菌体积的增大，而不是细菌数量的增多。

也有一些研究结果不支持上述结论，Lawal等[11]将鼠疫耶尔森菌常温(28 ℃)培养10 h后发现，两种重力条件下的细菌生长率并没有显著差异；考虑到鼠疫耶尔森菌能在寒冷环境下繁殖，研究人员又将细菌在4 ℃条件下培养10 d，发现不同重力两组细菌的总数没有显著差异。Benoit等[12]关于失重对不同细菌产生不同影响的解释是，是否具有鞭毛可能是影响细菌在失重或模拟失重条件下增殖情况的关键因素，失重条件下没有鞭毛的细菌菌体细胞悬浮于培养液中，营养物质和代谢产物相对静止在细胞周围，产生了不同于培养液大环境的适宜细菌生长的龛环境，没有鞭毛的细菌在龛环境下增殖速度加快。而具有鞭毛的细菌在游动时会破坏菌体周围相对稳定的液体环境，不能产生适宜生长的龛环境，因而未发现增殖速度的改变。

细菌的增殖速度加快会影响其在太空中的生物效应，例如加快腐蚀飞船构件，影响在轨人员的健康等，找出不同菌种在失重条件下的增殖变化规律，有针对性地制定在轨防控措施，是保障在轨人员健康及延长航天器寿命的有效手段。

2 失重对细菌毒力的影响及机制

毒力是致病菌致病性的关键因素，Nickerson等[3]为了研究失重对沙门氏菌毒力的影响，通过小鼠口腔灌注实验发现，模拟失重组沙门氏菌的半数致死量从2.2×107CFU降低到了0.43×107CFU；予以小鼠口腔灌注浓度为106CFU的沙门氏菌发现，模拟失重组的小鼠平均死亡时间比正常重力对照组减少；感染后10 d的生存率对比：模拟失重条件组为20%，而正常重力组为60%；在灌注后第6天解剖，发现在肝脏和脾脏中细菌的浓度(cfu/g)差异巨大，其中在脾脏当中模拟失重组比对照组高出27倍，在肝脏当中高出12.5倍。

美国国家航空航天局(National Aeronautics and Space Administration,NASA)在STS-115任务期间搭载的沙门氏菌分别培养在LB培养基和M9培养基(磷酸盐浓度更高)，结果发现在LB培养基组的沙门氏菌毒力增强，而M9培养基组无变化。在接下来的STS-123任务期间，研究人员在LB培养基中加入磷酸盐后发现细菌的半数致死量增加，小鼠的存活率上升，以上结果提示磷酸盐浓度与失重条件下沙门氏菌毒力呈负相关[13]，该研究还发现，失重能下调与脂多糖(LPS)链合成相关的rfb操纵子，与此一致的结果是在模拟失重条件下，总体LPS水平是降低的。在沙门氏菌中，有一些毒力相关基因位于毒力岛SPI-1和SPI-2 上，编码沙门氏菌的III型分泌系统(Type Ⅲ Secretion System,T3SS), Wilson等[8]发现，尽管细菌毒力实验表明沙门氏菌在失重条件下毒力增强[3,13-14]，但是T3SS的表达在失重状态下却是下降的。这个看似矛盾的结果提示，失重影响沙门氏菌毒力可能不依赖传统毒力因子T3SS，或者通过其他的通路进行调控。

Wilson等[15]的进一步研究对沙门氏菌进行全基因组转录和蛋白质组分析发现，失重导致毒力增强可能是通过调节转录后主要调控因子Hfq的表达，进而影响sRNA/Hfq作用来实现的。Allen等[16]发现模拟失重可以使黏附侵袭型大肠埃希菌(AIEC)对哺乳动物胃肠道上皮细胞系(Caco-2)的黏附性更强，当已知的环境压力调节相关因子RpoS缺失时，AIEC对于宿主细胞的黏附更加紧密，但是侵袭型却没有变化。类似的结果在沙门氏菌中也有发现，模拟失重让细菌更加耐酸、耐热，但是却被证明与rpos无关。Chopra等[14]利用Northern blot分析致病性大肠埃希菌(EPEC)发现，在模拟失重状态下，EPEC中编码LT-1毒素的基因上升了8～10倍。

并不是所有细菌的毒力都在失重条件下增强，Lawal等[17]对鼠疫耶尔森菌进行研究，细胞毒力测试并直接检测毒力因子YopM蛋白发现，模拟失重条件下鼠疫耶尔森菌细胞毒力减弱，YopM蛋白分泌减少，推测可能与失重条件下T3SS受抑制有关。此外单核细胞增多性李斯特菌、粪肠球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌也被证明在失重条件下毒力下降[18]。

太空环境中医疗条件有限，对于细菌的感染以预防为重点，条件致病菌在太空环境下毒力增加导致感染机会变大，研究细菌毒力增强的机制对于预防其感染有着重要的意义。

3 失重对细菌环境抵抗力的影响及机制

在不同的环境下，细菌会通过调节自身代谢来维持生存，细菌对环境的抵抗力增强会增加潜在的感染风险。早在20世纪80年代，Tixador等[19-20]通过研究航天员体内共生的大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌发现，与正常重力组相比，多粘菌素 E 和卡那霉素对大肠埃希菌的最低抑菌浓度从4 mg/L增加到16 mg/L，苯唑西林、红霉素和氯霉素对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度也略有增加，Lynch等[21]进一步的研究发现，这种耐药性的增强与失重条件下细菌生物被膜的增厚无关。

Nickerson等[3]把沙门氏菌加入pH为3.5的培养液中培养，研究其对酸性环境的抵抗力。结果显示，模拟失重组的沙门氏菌在酸性环境的生存率比正常重力组高3倍，这可能是口腔灌注后，模拟失重组沙门氏菌造成小鼠死亡时间缩短、半数致死量降低等的原因之一。模拟失重还能调控fur基因(编码三价铁摄取调节因子Fur)，Wilson等[22]用fur基因缺失株沙门氏菌在酸性条件下进一步实验发现，模拟失重暴露组对酸性环境无抵抗力，这证明Fur与RpoS不同，在模拟失重条件下，Fur与沙门氏菌酸性抵抗力直接相关。

Wilson等[15]对沙门氏菌进行了全基因组转录和蛋白质组分析，得出了环境因素对于Hfq影响较为完善的结果，167种差异表达基因中64个属于Hfq调节子，hfq基因本身也表达下降；Hfq参与了外周压力信号通路，此信号通路依赖RpoE、DksA和RseB三个蛋白的激活[23]，失重条件下3种蛋白的基因表达出现差异；外膜蛋白A(OmpA)、外膜蛋白C(OmpC)和外膜蛋白D(OmpD)的mRNA及蛋白水平与RpoE表达密切相关[24]，在失重条件下这三种mRNA的量随着hfq下调而升高；Fur蛋白在沙门氏菌环境压力抵抗中起到关键作用[22]，Hfq能调节Fur蛋白的表达，间接影响细菌对环境的抵抗力，相关实验也证实了以上结果，hfq缺失的突变株与野生型沙门氏菌相比，在酸性条件下的生存率显著降低。Pacello等[25]发现模拟失重培养沙门氏菌抗氧化能力增强，进一步的机理研究发现，这种抗氧化能力的增强并不依赖于传统的环境因素抵抗相关因子Hfq、RpoE和RpoS，而是通过增加过氧化氢酶KatG和KatN的表达来实现的。

也有一些针对其他菌株的研究没能得出相似的结果，Lawal等[26]以鼠疫耶尔森菌为对象进行研究，发现不同重力的两组细菌在RAW细胞中的增殖并没有显著差异。谢琼等[27]选用13株菌株进行航天搭载后发现，菌株搭载后的耐药性遗传指标基本稳定。

细菌的环境抵抗力是决定其能否被杀灭的关键，研究其失重条件下抵抗力增强的机制并制定相对应的消毒灭菌措施能减小细菌在太空中的危害。

4 失重对细菌被膜形成的影响及机制

生物被膜(biofilm)是指细菌黏附于接触表面，所分泌的多糖基质将其包绕其中而形成的膜样物，生物被膜的形成被RpoS所编码的因子σs调控[28]。生物被膜可增加细菌对于外环境(氧化、酸碱性、渗透压、抗生素等)的抵抗力。

Lynch等[21]用高盐环境、酒精、氯霉素及青霉素对大肠埃希菌进行测试，4种环境因素分别通过产生高渗透压、影响细胞膜稳定性、阻断肽聚糖的合成、阻断蛋白质的合成影响细菌。首先发现在失重条件下，细菌可形成更厚更致密的生物被膜，对于4种环境因素也有更强的抵抗力，但是当rpos基因缺失时，该菌株形成的生物被膜变薄，对于高渗透压及酒精的抵抗力降低，但是对于两种抗生素的抵抗力却没有变化，这个结果说明失重导致的大肠埃希菌对于抗生素抵抗力增强不依赖于生物被膜的形成，至少有两种通路导致失重条件下细菌对于不同类型的环境因素抵抗力增加。

Kim等[7]对铜绿假单胞菌生物膜进行分析发现，搭载后形成生物被膜的细菌数比地面组增加了3倍，细菌生物被膜的生物量和平均膜厚度也显著增加，研究还发现，培养基中磷酸盐浓度对生物被膜的形成有影响，当培养基中磷酸盐浓度从5 mmol/L增加到50 mmol/L时，形成生物被膜的细菌数增加了5倍，生物被膜的生物量和膜厚度也显著增加；通过野生型与鞭毛缺失的突变株进行对比研究后发现，在失重条件下，突变株形成生物被膜的细菌数比正常重力对照组多了8倍，但是生物被膜的生物量和膜厚度却没有显著变化，这提示生物被膜的形成可能与菌体的运动有关。

卧床模拟失重实验发现，模拟失重条件下人的龋齿发病率增高，Cheng等[29]对引起龋齿的主要病原菌变异链球菌进行研究发现，在模拟失重条件下，变异链球菌的生物被膜结构、细胞外多聚糖的分布出现变化，出现双重生物被膜的细菌比例升高，但引起这一系列变化的具体机制尚不明确。

5 展 望

随着载人航天技术的发展，人类探索太空的脚步将会越走越远。但是许多限制因素如航天器动力、深空辐射、微生物威胁等，这些将是未来研究的热点。

目前失重条件下细菌的研究范围有限，主要集中在大肠埃希菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌等，而且机制研究不透彻，很多问题亟待解决，例如T3SS已被证明与沙门氏菌毒力有关，但沙门氏菌在失重条件下毒力增强却不依赖于T3SS；失重造成细菌对抗生素抵抗力增高的机制；Hfq是怎样与sRNA一起共同影响细菌毒力、增殖、被膜形成等。为了保障未来的航天飞行安全，微生物控制的问题必须解决，失重影响微生物的机制研究是解决问题的基础。

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Advances in Weighlessness Effect on Bacteria and Relative Mechanism

RONG Dan, WANG Jia-ping, GAO Jian-yi, LI Yong-zhi

(AstronautCenterofChina,Beijing100094)

Weighlessness is a main environmental factor in space, and human body as well as spacecraft could carry bacteria into space. Weighlessness could certainly affect the phenotype variation of the opportunistic pathogens likeSalmonellatyphimurium,EscherichiacoliandPseudomonasaeruginosa, and emerge the variation of proliferation, virulence, bio-membrane, and environmental resistance etc. Moreover, weighlessness could cause immune in human body to decline, and let the opportunity of bacterial infection to increase. This paper summarized the effects and mechanism of weighlessness on bacteria, so as to provide new train of thought on related studies.

weightlessness; bacteria; virulence; biofilm

十二五重大新药创制项目(2015ZX09J15102-002)

容丹 男，硕士研究生。研究方向为航天实施医学。Tel：010-66362388，E-mail：rdshanghai@163.com

* 通讯作者。女，研究员。研究方向为免疫药理学。Tel：010-66362380，E-mail：lyz0316@sina.com

2015-07-20；

2015-09-16

Q939.99

A

1005-7021(2016)03-0100-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.03.019