五子降糖方对T2DM大鼠血糖、C-P及DPP-4活性影响的实验研究*

周雪梅，董玉山，喇孝瑾，田春雨，高秀娟，贺宝玲，刘玉洁，李继安，陈 震，史佳森，袁丽丽，仇继超

（1.华北理工大学中医学院，唐山 063000；2.唐山市迁西县卫生局，迁西 064300；3.匈牙利东方国药集团，匈牙利布达佩斯 1174）

五子降糖方对T2DM大鼠血糖、C-P及DPP-4活性影响的实验研究*

周雪梅1，董玉山1，喇孝瑾1，田春雨1，高秀娟1，贺宝玲1，刘玉洁2，李继安1，陈 震3，史佳森1，袁丽丽1，仇继超1

（1.华北理工大学中医学院，唐山 063000；2.唐山市迁西县卫生局，迁西 064300；3.匈牙利东方国药集团，匈牙利布达佩斯 1174）

[目的]探讨五子降糖方对二肽基肽酶Ⅳ（DPP-4）活性的影响，研究其发挥降糖作用的可能机制。[方法]选取SPF级雄性GK大鼠，适应性喂养1周后给予高脂饲料，连续喂养4周，测定血糖，以随机血糖＞11.1 mmol/L或餐后2 h血糖（2 h PG）＞16.7 mmol/L为成模标准，将成模2型糖尿病（T2DM）大鼠随机分为模型组、二甲双胍组（0.1 g/kg）、五子降糖方低、中、高剂量组（3.5、7.0、14 g/kg，折合生药量），同时另选Wstar大鼠为正常组，正常组与模型组灌胃等体积纯净水，灌胃前测定空腹血糖（FBG），灌胃后4周、8周测定FBG及2 h PG，8周后处死动物，检测血清C肽（CP）水平；采用发色底物法建立DPP-4抑制剂体外筛选模型，分别应用五子降糖方及其组方的各味单药菟丝子、女贞子、紫苏子、莱菔子、车前子水提物对DPP-4抑制剂体外筛选模型进行干预，以磷酸西格列汀片作为阳性对照药，测定A值，计算DPP-4抑制率，比较IC50差异。[结果]五子降糖方可降低T2DM大鼠FBG及2 h PG，增高血清C-P水平；对DPP-4抑制作用，五子降糖方IC50为（6 667.754±2 119.759）mg/L，其组成药物中莱菔子IC50为（382.554± 7.750）mg/L，菟丝子IC50为（843.391±135.230）mg/L。[结论]五子降糖方可以降低T2DM FBG及2 h PG，改善胰岛β细胞功能，作用机制可能与DPP-4抑制作用有关，其中莱菔子、菟丝子可能是本方发挥DPP-4抑制作用的主要药物。

二肽基肽酶Ⅳ（DPP-4）；五子降糖方；2型糖尿病（T2DM）；GK大鼠

二肽基肽酶Ⅳ（DPP-4）抑制剂是一种新型2型糖尿病（T2DM）治疗药物，主要通过延长体内胰高血糖素样肽-1（GLP-1）降解时间，促进胰岛素分泌，发挥葡萄糖浓度依赖性降糖作用。前期实验表明五子降糖方可有效改善糖代谢，但此方是否通过抑制DPP-4活性发挥降糖作用需要进一步验证，本实验观察了五子降糖方对T2DM大鼠空腹及餐后血糖、血清C肽（C-P）的影响，建立DPP-4抑制剂体外筛选模型，对五子降糖方及其组成药物进行筛选，探讨其发挥降糖作用及改善胰岛β细胞功能的新机制。

1 材料

1.1 实验动物 SPF级GK雄性大鼠54只，体质量（300±20）g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号SCXK（沪）2012-0002，动物合格证编号2007000577867。饲养于华北理工大学10000级屏障环境动物实验室[SYXK（冀）2010-0038]，室温20℃，相对湿度45%，光暗周期（12 h/12 h）。

1.2 药物与试剂 五子降糖方由菟丝子、女贞子、紫苏子、莱菔子、车前子组成，购自北京同仁堂唐山连锁药店有限公司，磷酸西格列汀片（杭州默沙东制药有限公司，产品批号k005113），DPP-4（Sigma公司，批号SLBK3698V），甘氨酰脯氨酸对硝基苯胺（Sigma公司，批号SLBJ8491V），C肽测定试剂盒（北京凯诺春天生物科技有限公司，批号20150401A），二甲双胍片（中美上海施贵宝制药有限公司，批号1407117）。

1.3 主要仪器 BS224S精密电子天平（德国Sartorius公司），GZX-9240数显鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂），M200PRO酶标仪（瑞士Tecan公司）。

2 方法

2.1 药物提取方法 五子降糖方按照其组成药物菟丝子∶女贞子∶紫苏子∶莱菔子∶车前子（3∶3∶2∶2∶2）比例混合，8倍量加水煎煮2 h，煎煮2次，2次药液混合，浓缩收膏，浓缩收膏率31%。

2.2 GK大鼠造模、分组、给药与指标检测 54只GK大鼠适应性喂养1周，给予高脂饲料喂养，连续4周，测定空腹血糖（FBG）和餐后2 h血糖（2 h PG），随机血糖＞11．1 mmol/L，2 h PG＞16．7 mmol/L[1]为成模标准，共成模50只，将成模GK大鼠随机分为模型组、二甲双胍组（简称二甲组）、五子降糖方高、中、低剂量组（简称五子高中低组），每组10只。选取10只Wistar大鼠作为正常组，给予普通饲料喂养。各组灌胃相应药物，模型组与正常组灌胃等体积纯净水，给药量按照大鼠与人换算公式计算（每日7．5 mg/kg）[2-3]，二甲组灌胃0．1 g/kg盐酸二甲双胍混悬液，五子降糖方分别灌胃3．5、7．0、14．0 g/kg（折合生药量），共给药8周，采用葡萄糖氧化酶法测定给药前、给药后大鼠FBG及2 h PG，给药8周后取大鼠腹主动脉血清，采用酶联免疫吸附（ELISA）方法检测C-P水平。

2.3 DPP-4抑制剂体外筛选体系的建立及对五子降糖方及组成药物进行DPP-4抑制剂的筛选 实验分4组[4-7]，每组设3个复孔，分别为空白组、阴性对照组、阳性对照组、阳性空白组，具体见表3。按照药物、酶、缓冲液、底物顺序加入96孔板，37℃孵育30 min，于405 nm处测定吸光度（A），经反复摸索确定反应体积为100 μL，对酶浓度、底物浓度、反应缓冲液pH值、反应时间进行优化。设1、2、3、4、5 mg/L浓度梯度的磷酸西格列汀片[8]对上述反应体系进行验证。DPP-4抑制剂体外筛选模型建立后，保留原分组，加干预药物组、干预药物空白组对五子降糖方及其组方单味中药进行筛选，干预药物浓度设为200 mg/L，按照上述反应体系对干预药物进行初步筛选，剔除DPP-4抑制作用不明显的药物，对DPP-4抑制率＞10%的药物进行复筛，复筛药物设25、50、100、200、400 mg/L 5个浓度梯度，测定A值，计算抑制率，比较IC50差异。

2.4 统计学处理 实验数据应用SPSS 20．0软件及Excel 2007进行分析，实验结果均以均值±标准差（s）表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较方差齐采用LSD法，方差不齐采用Dunnett’s T3法，P＜0．05为差异有统计学意义。

抑制率计算公式：[（阴性对照组-阴性空白组）-（阳性对照组-阳性空白组）]/[（阴性对照组-阴性空白组）]。

3 结果

3.1 五子降糖方对T2DM大鼠FBG和2 h PG影响 测定大鼠FBG，见表1。给药前各组与正常组比较均有显著性差异（P＜0．01），但各组之间不存在差异性（P＞0．05）。给药4周后测定FBG，与正常组比较，模型组、二甲组、五子低组有显著性差异（P＜0．01），FBG水平都高于正常组，五子中组、五子高组没有差异（P＞0．05）。与二甲组比较，五子低组没有显著性差异（P＞0．05），效果相当，五子中组、五子高组均有显著性差异（P＜0．01），效果优于二甲组，给药8周后，FBG五子各组均与正常组无显著性差异（P＜0．05），效果优于二甲组。测定大鼠2 h PG，见表2。给药前模型组与五子各组之间没有差异性（P＞0．05），给药4周后与模型组比较二甲组、五子低组存在差异（P＜0．05），五子中组、五子高组差异显著（P＜0．01），二甲组与五子各组比较（P＞0．05），效果相当。给药8周后各组与模型组比较均有显著性差异（P＜0．01），与二甲组比较五子低组存在差异（P＜0．05），五子中组、五子高组均存在显著性差异（P＜0．01），五子各组效果均优于二甲组。

表1 五子降糖方对T2DM大鼠FBG的影响（s）mmol/L

表1 五子降糖方对T2DM大鼠FBG的影响（s）mmol/L

注：与正常组比较，**P＜0．01；与模型组比较，#P＜0．05，##P＜0．01；与二甲组比较，△P＜0．05，△△P＜0．01。

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表2 五子降糖方对T2DM大鼠2 h PG的影响（s）mmol/L

表2 五子降糖方对T2DM大鼠2 h PG的影响（s）mmol/L

注：与模型组比较，*P＜0．05，**P＜0．01；与二甲组比较，#P＜0．05，##P＜0．01。

?

3.2 五子降糖方对T2DM大鼠C-P影响 正常组与模型组二甲组、五子低组比较均存在显著性差异（P＜0．01），与五子中组、五子高组比较不存在差异（P＜0．05）。与模型组比较，二甲组、五子低组，存在差异（P＜0．05），五子中组、五子高组，存在显著性差异（P＜0．01）。二甲组与五子低组比较不存在差异性（P＜0．05），效果相当。与五子中组比较（P＜0．01），与五子高组比较（P＜0．05），效果优于二甲组。见表3。

表3 五子降糖方对T2DM大鼠C-P影响（s） μg/mL

表3 五子降糖方对T2DM大鼠C-P影响（s） μg/mL

注：与正常组比较，**P＜0．01；与模型组比较，#P＜0．05，##P＜0．01；与二甲组比较，△P＜0．05，△△P＜0．01。

10 10 10组别正常组模型组二甲组n C肽n C肽10 10 10 242±08．8 202±07．3** 211±10．9**#组别五子低组五子中组五子高组212±7．7**#239±4．8##△△235±9．6**##

3.3 DPP-4抑制剂体外筛选模型的优化结果 见表4。

表4 反复摸索后DPP-4抑制剂体外筛选体系各成分加入量 μL

3.4 五子降糖方及其组成药物对DPP-4的抑制作用 初筛结果女贞子、车前子、紫苏子抑制作用不明显，对莱菔子、菟丝子、五子降糖方进行复筛，复筛结果见表5。莱菔子IC50为（382．56±7．75）mg/L，菟丝子IC50为（843．39±135．23）mg/L，五子降糖方IC50为（6 667．75±2 119．76）mg/L，磷酸西格列汀片IC50为（0．11±0．00）mg/L，对DPP-4抑制作用强弱比较磷酸西格列汀片＞莱菔子＞菟丝子＞五子降糖方总方。

4 讨论

2型糖尿病属中医消渴范畴，中医学认为本病是一种虚实夹杂的复杂证候，《灵枢五脏》云：“肾脆则善病消瘅，易伤。”《外台秘要·消渴消中门》强调：“消渴者，原其发动，此则肾虚所致，每发即小便至甜。”进一步说明肾亏是其患病的关键。《素问·通评虚实论》言：“消瘅……肥贵人，则膏梁之疾也。”《素问奇病论篇》云：“脾瘅，此肥美之所发也，此人必数食甘美而多肥也。”则强调了过食肥甘厚味可致消瘅；由此可见先天不足，气化不及与后天饮食肥甘太过是消渴病发病的主要因素。气化功能下降为发病之根，脂浊痰湿堆积为发病之因，五子降糖方中菟丝子温补肾阳的同时平补肾阴，女贞子性凉，归肝肾经，具有滋补肝肾之阴的功效，两者合用，使肾之阴阳得补，肾气得充，进而蒸腾、气化推动和调节胃之“游溢精气”、脾之“散精”、肺之“通调水道”，使津液输布代谢正常，则痰浊无以内生。紫苏子降气消痰，莱菔子消食导滞、下气除痰，车前子泻而通之，泻有形之邪浊，涩中兼通，补而不滞。五药配伍使肾虚得补、气机得畅、痰浊得化。现代药理表明菟丝子及其单体成分可能通过抑制α-淀粉酶的活性、抗氧化应激、增强免疫功能等发挥降糖作用[9-10]，女贞子提取物及其单体成分降糖作用可能与抑制α-葡萄糖苷酶、改善胰岛素抵抗相关[11]，莱菔子可以调节血脂，提高高密度脂蛋白胆固醇（HDL-c）水平[12]。前期实验研究表明五子降糖方可以降低2型糖尿病大鼠FBG和2 h PG血糖，增加肝脏糖原含量，其机制可能与提高骨骼肌葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）表达水平、抗氧化、抗炎及改善胰岛β细胞功能，提高肝脏蛋白激酶（AKT）及糖原合酶激酶-3β（GSK-3β）丝氨酸位点磷酸化水平有关[13-15]。由此说明该方是通过多途径、多环节、多靶点发挥整体降糖作用的，除上述已经阐释的作用机制外，是否还有其他改善糖代谢机制尚需进一步探讨。

表5 初筛抑制率＞10%的药物及磷酸西格列汀片对DPP-4的抑制作用（s）

表5 初筛抑制率＞10%的药物及磷酸西格列汀片对DPP-4的抑制作用（s）

五子降糖方6 667．75±2 119．76磷酸西格列汀片4 4 50．0 100．0 200．0 400．0 25．0 50．0 100．0 200．0 400．0 000．1 000．2 000．3 000．4 000．5 0．12±0．01 0．18±0．01 0．21±0．02 040±0．01 0．09±0．01 0．15±0．01 0．17±0．01 0．20±0．01 0．26±0．01 0．48±0．01 0．64±0．01 0．75±0．01 0．78±0．07 0．82±0．00 0．11± 0．00

GK大鼠是一种自发性非肥胖型糖尿病模型大鼠，在远交系Wistar大鼠中筛选高血糖个体而成。糖尿病发作后，很快出现高血糖、胰岛素分泌减弱等症状，后期容易出现视网膜、微血管、神经、肾脏病变等，其发病机制与T2DM机制及其类似[16-17]。本实验选取GK模型大鼠，结果表明，正常组GK大鼠毛色较白且有光泽，精神状态活跃，粪便及尿量正常，模型组毛色明显发黄无光泽，精神状态萎靡，尿量增多且部分大鼠出现便溏，二甲组及五子各组状况较模型组均有所改善。给药4周后测定FBG，五子中组、五子高组可以将GK大鼠FBG降低到正常水平，五子低组与二甲组效果相当，五子中组、五子高组降糖效果优于二甲组。给药8周测定FBG水平，五子各组均可以达到正常水平，效果优于二甲组。测定2 h PG，给药4周后二甲组与五子各组效果无差异性，给药8周五子各组效果均较二甲组明显。GK大鼠模型组C-P水平减少，提示胰岛β功能损伤，五子降糖方可以显著增高C-P，降低GK大鼠FBG及2hPG水平，并且可以改善胰岛β细胞功能。

近年来以DPP-4抑制为靶点的中药降糖机制研究报道越来越多，DPP-4抑制是一种新的T2DM治疗途径，其主要通过延长体内GLP-1降解时间发挥降糖作用。GLP-1是一种肠促胰岛素，体内外研究显示GLP-1具有较好的抗糖尿病效应，它具有血糖依赖性的肠促胰岛素作用，可以避免餐后高血糖的风险，同时又阻止胰腺β细胞退化，刺激β细胞的增殖和分化，促进胰岛素的释放[18-21]，可改善糖尿患者的血糖代谢。但是由于GLP-1在体内很快被以DPP-4为主的酶降解，因而抑制DPP-4能一定程度延长GLP-1在体内的半衰期，从而有效地发挥GLP-1降血糖效应。近年来，已有学者开展了以DPP-4抑制为靶点的中药研究，并且发现葫芦巴、鹰嘴豆、石榴皮、水蛭、茯神、密蒙花等具有一定的DPP-4抑制作用[4-6]。本实验证明五子降糖方可以有效降低GK大鼠FBG和2 h PG血糖，改善胰岛β细胞功能，为了进一步探讨该方的作用机制，又对五子降糖方及其组成药物进行了DPP-4抑制作用的筛选，实验结果表明五子降糖方具有DPP-4抑制作用，莱菔子、菟丝子可能是其发挥DPP-4抑制作用的主要药物，进而说明五子降糖方的DPP-4抑制作用是其降低血糖，改善胰岛β细胞功能的又一作用机制，因该方均为天然植物中药，安全性好，不良反应小，适合长期服用，对指导临床和药物开发具有重要意义。

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Experimental study of effect of Wuzi Jiangtang Formula on glucose and C-P of T2DM mice and DPP-4 activity

ZHOU Xue-mei1,DONG Yu-shan1,LA Xiao-jin1,TIAN Chun-yu1,GAO Xiu-juan1,HE Bao-ling1, LIU Yu-jie2,LI Ji-an1,CHEN Zhen3,SHI Jia-sen1,YUAN Li-li1,QIU Ji-chao1
（1．North China University of Science and Technology,Tangshan 063000,China;2.Health Bureau of Qianxi County of Tangshan City,Tangshan 064300,China;3.Oriental Herbs Kft.,Budapest 1174,Hungary）

[Objective]To investigate the effect of Wuzi Jiangtang Formula on the effect of DPP-4,and study the possible mechanism of its hypoglycemic effect．[Methods]Select SPF male GK rats,the rat model of T2DM was established by feeding high fat for 4 weeks after adaptive feeding 1 week,detect blood glucose,FBG＞11．1 mmol/L or 2 hPG＞16．7 mmol/L was considered succeed model．And the T2DM rats were randomly divided into model group, metformin group,Wuzi Jiangtang Formula groups with high,medium and low dose respectively,normal group．The normal group and model group were administered intragastrically with pure water．Other groups were administered intragastrically with corresponding drugs for 8 weeks．The level of FBG was detected at the beginning of treatment, and at the ends of the 4th and 8th week．The rats were sacrificed after 8 weeks．The level of C-P were detected; Establish vitro screening model of DPP-4 inhibitor,and screen Wuzi Jiangtang Formula and its component drugs, which including Tusizi,Nvzhenzi,Suzi,Laifuzi and Chenqinzi．Select the Sitagliptin Phosphate Tablets as positive control drug．Then determine the absorbance(A),calculate the inhibition rate,and compare the difference of IC50．[Results]Wuzi jiangtang Formula can reduce the level FBG,2 hPG and C-P;IC50of Wuzi jiangtang Formula is(6 667．754±2 119．759)mg/L,IC50of Laifuzi is(382．554±7．749 6)mg/L,inhibition of DPP-4,IC50of Tusizi is (843．391±135．23)mg/L．The inhibitory effect of DPP-4 of Cheqianzi,Suzi and Nvzhenzi is less than 10%．[Conclusion]Wuzi Jiangtang Formula can reduce the level FBG and 2 h PG,improve the islet β cell function．The inhibitory effect on DPP-4 is the possible mechanism,and Laifuzi,Tusizi are probably the main drugs play an important role in the inhibition of DPP-4．

DPP-4;Wuzi Jiangtang Formula;Type 2 diabetes mellitus;GK rat

R587.1

A

1673-9043（2016）06-0390-05

2016-07-01）

10.11656/j.issn.1673-9043.2016.06.08

河北省科技计划项目（13392502D）；河北省中医药管理局科研计划项目（2013066）；华北理工大学大学生创新创业训练计划项目（X2014112）。

周雪梅（1988-），女，硕士研究生，主要从事中医糖脂代谢疾病研究。

李继安，E-mail:lnyy@vip.sina.com。