10种药物材料对铜绿微囊藻的抑制作用*

胡利静 肖艳翼 刘腾飞 吴映捷 胡 鲲 杨先乐

(上海海洋大学水产与生命学院，国家水生动物病原库，上海 201306)

蓝藻(Cyanophyta)是单细胞原核生物，又叫蓝细菌、蓝绿菌或蓝绿藻，是一类藻类的总称，主要指色球藻目(Chroococcales)、颤藻目(Oscillatoriales)、念珠藻目(Nostocales)、真枝藻目(Stigonema)4个目，可在营养丰富的淡水水体中出现。蓝藻中有些种类常于夏季高温时大量繁殖，并在水面形成一层蓝绿色且有腥臭味的浮沫，称为“水华”。蓝藻水华的种类有很多，主要有微囊藻(Microcystis)、鱼腥藻(Anabaena)、鞘颤藻(Lyngbya)、束丝藻(Aphanizomenon)、颤藻(Oscillatoria)[1]，其中以产毒的铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)最为常见。铜绿微囊藻大量繁殖时，水面会被厚厚的蓝绿色湖靛所覆盖，改变了水体的理化环境，降低了水体的透明度[2]，影响鱼虾等水生动物的正常生长；水体中营养物质被耗尽时，铜绿微囊藻开始大量死亡，藻细胞破解，使水体散发腥臭味，溶解氧减少，造成鱼虾等水生动物的死亡，所以池塘养殖水体中过量的铜绿微囊藻威胁着水产养殖业的健康发展，因此研发绿色环保的抑藻药物势在必行。

目前水产养殖中蓝藻的除杀多采用人工或机械打捞、化学药物杀藻等方法。人工或机械打捞的方法虽见效快，但劳动强度大、操作困难、耗时、效率低而且费用高，因此实际生产中以化学药物抑藻方法为主。水产养殖中常用的化学抑藻药物为硫酸铜，但硫酸铜的大量使用和使用次数的增加常会使重金属在养殖水域中积累，引发二次污染，并影响水生生物生长等。因此，寻求经济、安全、环保、有效的抑藻药物，对水产养殖业的健康发展具有重要的意义。本研究从药食两用的植物及常见的中草药中选择了10种药物材料，对铜绿微囊藻进行抑制效果筛选试验，并对初筛药物的有效剂量进行测定，以期为开发绿色环保的抑藻药物提供一定的技术指导。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

1.1.1 供试藻种

铜绿微囊藻藻种购买于中国科学院野生生物种质库——淡水藻种库，编号为FACHB-434。

1.1.2 抑藻材料

蜜桔、马水桔、蜜柚、大蒜从市场上购得；铁观音、大麦茶购于商店；仙鹤草、大黄、土槿皮提取物、黄连提取物等购于药店。

1.1.3 主要仪器

MGC-250BPY-2智能型光照培养箱；DU730分光光度计(美国Beckman)；Allegra X-15R低速冷冻离心机(美国Beckman)。

1.2 培养基组分及培养条件

铜绿微囊藻的培养按淡水藻种库提供配方，采用BG11培养基培养。培养条件为：温度(25.0±0.5) ℃，光照强度3 000 lx，光暗比12 h∶12 h，每天摇动3～5次。

1.3 浸提液制备方法

蜜桔皮、马水桔皮、蜜柚皮水提液的制备参考文献[3]的提取方法，自来水冲洗柑橘皮表面灰尘，将柑橘皮切成小块，在烘箱中干燥。以桔皮(干质量，下同)/去离子水为0.05 kg/L的比例，用去离子水在4 ℃黑暗中浸提4 d。

大蒜液制备：称取100 g去皮大蒜，加入100 mL去离子水，搅拌成糜状后挤压得汁液，置于磨口试剂瓶中，室温保存，大蒜质量浓度为1 kg/L。

铁观音、大麦茶浸提液制备：称取铁观音、大麦茶2 g，加去离子水20 mL，煮沸10 min，重复一次，合并两次茶液并用去离子水定容至20 mL，使茶液的最终质量浓度为100 g/L作为试验原液，4 ℃保存备用。

仙鹤草、大黄浸提液制备参考文献[4]的提取方法，按药物/蒸馏水为0.10 kg/L的比例分别将两种药物加入盛一定量蒸馏水的烧杯中，置于电炉上煮沸浸提，煮沸20 min后滤出药液，定容，使药液质量浓度为100 g/L作为试验原液，4 ℃保存备用。

土槿皮提取物、黄连提取物浸提液制备:按药物/蒸馏水为0.05 kg/L的比例分别将两种药物加入盛一定量蒸馏水的烧杯中，煮沸10 min后过滤，定容，使药液质量浓度为50 g/L作为试验原液，4 ℃保存备用。

1.4 试验方法

1.4.1 筛选试验

将铜绿微囊藻在BG11培养基下预培养10～15 d，使其处于对数生长期，作为接种的藻种。在无菌条件下，在250 mL的锥形瓶中各加入20 mL藻液，初始叶绿素a为0.340 6 μg/mL，并分别加入一定量的浸提液，最后加入无菌培养基，使培养液总体积为100 mL。最终使蜜桔皮、马水桔皮、蜜柚皮水提液质量浓度均为6.25 g/L，大蒜液和铁观音、大麦茶、仙鹤草、大黄浸提液的质量浓度均为5.000 g/L，土槿皮提取物、黄连提取物浸提液的质量浓度均为2.500 g/L。每组3个平行，并设空白对照组。

1.4.2 有效药物最佳抑藻浓度确定

根据筛选结果，采用二倍稀释法将有效药物的母液依次倍数稀释，查看抑藻效果，确定药物的最佳抑藻浓度。每组3个平行，并设空白对照组。

1.4.3 测定指标

由于活体藻类中叶绿素a的含量较高，而在死亡藻体、浮游动物及其他无机漂浮物中叶绿素a的含量较低，因此把叶绿素a含量的测定作为测量藻类生物量的重要指标[5]。

叶绿素a测定：参考文献[6]的测定方法，即取3 mL培养液，3 500 r/min下离心10 min，弃去上清液，然后加入等体积90%的(体积分数)甲醇，混合均匀。将混匀的溶液放置在4 ℃黑暗条件下萃取6～8 h，然后3 500 r/min下再离心10 min，取上清液，用分光光度计测定其在665 nm处的吸光度(OD665)，并计算叶绿素a的含量，计算公式[7]为：

c=13.9×OD665

(1)

式中：c为叶绿素a质量浓度，μg/mL。

表1 10种材料对铜绿微囊藻生长的抑制率1)

注：1)相同字母的数据间没有显著差异,不同字母的数据间差异显著。

1.5 数据分析

各浸提液对铜绿微囊藻生长的抑制率计算公式为：

IR=(1-N/N0)×100%

(2)

式中：IR为抑制率，%；N为浸提液组藻的叶绿素a质量浓度，μg/mL；N0为对照组藻的叶绿素a质量浓度，μg/mL。

所得数据用Excel 2003和IBM SPSS Statistics 19.0软件程序包进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 10种材料对铜绿微囊藻生长抑制率的影响

10种材料对铜绿微囊藻生长抑制率的影响如表1所示。经统计分析可知，从1 d时的抑制率来看，蜜桔皮、蜜柚皮、马水桔皮对铜绿微囊藻生长的抑制率较大；大黄、土槿皮提取物、黄连提取物对铜绿微囊藻的抑制率次之，且3者之间无显著差异；大蒜、大麦茶对铜绿微囊藻的抑制率最低。从2 d的抑制率来看，3种柑橘皮对铜绿微囊藻的抑制率依然较高，且明显高于其他7种材料对铜绿微囊藻的抑制率；大黄、土槿皮提取物、黄连提取物对铜绿微囊藻的抑制率次之；仙鹤草、大蒜、大麦茶对铜绿微囊藻的抑制率较低。从3～5 d的抑制情况看，大蒜对铜绿微囊藻的抑制率上升较快；仙鹤草、大麦茶对其的抑制率仍保持较低水平；其他材料抑藻率较大，且不同的材料间有不同的差异性。

2.2 10种材料对铜绿微囊藻叶绿素a含量的影响

10种材料在不同时间内对铜绿微囊藻叶绿素a质量浓度的影响如图1所示。铜绿微囊藻各处理组作用的时间对叶绿素a含量的回归方程如表2所示，其中y为铜绿微囊藻的叶绿素a质量浓度，μg/mL；x为各处理组作用的时间，d。从图1及表2可以看出，蜜桔皮、马水桔皮、蜜柚皮、土槿皮提取物、黄连提取物浸提液组中铜绿微囊藻的叶绿素a含量随着时间延长呈下降趋势，各组间下降的幅度略有不同，马水桔皮>蜜桔皮>蜜柚皮>黄连提取物>土槿皮提取物。大蒜、铁观音、大麦茶、仙鹤草、大黄的浸提液组及对照组中铜绿微囊藻的叶绿素a含量随着时间延长呈上升趋势，大蒜、铁观音、大黄的浸提液组上升幅度明显小于仙鹤草和大麦茶，且这些浸提液组中叶绿素a含量的上升幅度均低于对照组的上升幅度，但仙鹤草和大麦茶浸提液组叶绿素a含量的上升幅度与对照组相差不大。

表2 铜绿微囊藻各处理组作用的时间对叶绿素a含量的回归方程

2.3 有效材料抑藻最佳浓度的确定

各质量浓度蜜桔皮水提液对铜绿微囊藻叶绿素a的作用效果如图2所示，其中0.39、0.78 g/L浓度组与对照组中铜绿微囊藻叶绿素a变化相似；1.56 g/L浓度组的铜绿微囊藻叶绿素a的合成呈上升趋势，但与对照组相比上升幅度降低，说明该浓度组对铜绿微囊藻叶绿素a的合成具有一定的抑制能力；3.13 g/L浓度组使铜绿微囊藻的叶绿素a基本维持在初始值(0.340 6 μg/mL)状态；而6.25、12.50、25.00 g/L浓度组能明显抑制铜绿微囊藻叶绿素a的合成。

图1 10种材料对铜绿微囊藻叶绿素a质量浓度的影响Fig.1 Effect of 10 kinds material on growth of M. aeruginosa

图2 蜜桔皮对铜绿微囊藻生长的影响Fig.2 Effect of Tangerine peel on growth of M. aeruginosa

如图3所示，马水桔皮水提液质量浓度为1.56 g/L时铜绿微囊藻的叶绿素a能基本维持在初始值状态，当小于1.56 g/L时对铜绿微囊藻叶绿素a的合成抑制率减弱甚至促进其合成，当大于1.56 g/L时能抑制铜绿微囊藻叶绿素a的合成。

如图4所示，蜜柚皮水提液0.78、1.56 g/L浓度组的叶绿素a与初始值相比略有增长，而3.13 g/L浓度组与初始值相比略有下降，0.39 g/L浓度组的叶绿素a反而超过了对照组的叶绿素a含量，而大于3.13 g/L的各浓度组均对铜绿微囊藻的叶绿素a合成具有抑制作用。

图3 马水桔皮对铜绿微囊藻生长影响Fig.3 Effect of Mashui orange peel on growth of M. aeruginosa

图4 蜜柚皮对铜绿微囊藻生长的影响Fig.4 Effect of Pomelo peel on growth of M. aeruginosa

大蒜液对铜绿微囊藻叶绿素a质量浓度的影响如图5所示。0.313 g/L浓度组对其叶绿素a的合成无抑制作用，其他各浓度组随着时间的延长叶绿素a含量总体呈增长趋势，但在同一个时间点其叶绿素a均低于对照组，且随着大蒜液浓度的增大叶绿素a含量的增长幅度降低。当其大于5.000 g/L时，叶绿素a含量基本维持在初始水平。

图5 大蒜对铜绿微囊藻生长的影响Fig.5 Effect of Allium sativum on growth of M. aeruginosa

图6、图7分别为铁观音、大黄浸提液对铜绿微囊藻生长影响趋势图。在2.500 g/L时两种材料均使铜绿微囊藻的叶绿素a维持在初始值附近；当大于2.500 g/L时两种材料均能有效抑制铜绿微囊藻叶绿素a的合成，且大黄的抑制效果好于铁观音；当小于2.500 g/L时，除大黄1.250 g/L浓度组外其他浓度组中的叶绿素a含量与对照组的接近且均呈增长趋势；大黄1.250 g/L浓度组叶绿素a含量虽有增长趋势，但明显低于对照组。

图6 铁观音对铜绿微囊藻生长的影响Fig.6 Effect of Tieguanyin tea on growth of M. aeruginosa

图7 大黄对铜绿微囊藻生长的影响 Fig.7 Effect of Radix et Rhizoma Rhei on growth of M. aeruginosa

如图8、图9所示，土槿皮、黄连提取物浸提液对铜绿微囊藻叶绿素a含量的影响相似。当大于2.500 g/L时，两种材料各浓度组中的叶绿素a均呈下降趋势，且浓度越大其下降幅度越大；当小于2.500 g/L时，两种材料各浓度组中的叶绿素a均呈上升趋势，且随着浓度降低其上升幅度增加，但各浓度组上升幅度均低于对照组。

图8 土槿皮提取物对铜绿微囊藻生长的影响Fig.8 Effect of Cortex Pseudolaricis on growth of M. aeruginosa

图9 黄连提取物对铜绿微囊藻生长的影响Fig.9 Effect of Rhizoma Coptidis on growth of M. aeruginosa

3 讨 论

目前，防治淡水水华的发生不仅是环境领域的热点[8]，也是淡水水产养殖业关注的焦点。随着抑藻技术的发展，国内外研究者研究溶藻菌[9-11]、水生植物[12-13]、陆生植物[14-16]等抑藻技术，尤其是植物化感作用因其具有经济、高效、绿色环保的特点，备受国内外学者亲睐[17-18]。目前研究报道的具有抑藻作用的水生植物有很多种[19-22]，但利用水生植物直接抑制铜绿微囊藻的作用效果并不理想，可能因水生植物长期生长并适应了该特定的环境从而不再产生对铜绿微囊藻的生长具有抑制作用的代谢产物[23]，也可能是其代谢产物长期在特定环境中抑藻效果逐渐消亡。目前，关于药物材料对铜绿微囊藻控制的研究，主要集中在个别药物材料的研究[24]。如潘琦等[25]研究美人蕉种植水对铜绿微囊藻的抑制效应时发现，以蒸馏水培养3 d收集获得的美人蕉种植水对铜绿微囊藻的生长有明显的抑制作用，且推断美人蕉自身代谢产生的化感物质可有效抑制铜绿微囊藻的正常生长。李娟等[26]发现，50 mg/L的H2O2能有效抑制铜绿微囊藻的生长，且对藻细胞的生理指标等有很强的损伤效应。汪小雄等[27]发现，浸泡5 d的荔枝落叶能抑制铜绿微囊藻的生长，且随着时间延长，抑制效应下降。而对于药物材料筛选方面的研究报道却较少[28]。因此，本试验选择了10种陆生药物材料，用其浸提液进行了对铜绿微囊藻生长抑制的研究，发现不同的药物材料浸提液对铜绿微囊藻生长表现出不同的抑制效果。具有较强抑藻作用的有蜜桔皮、马水桔皮、蜜柚皮、大黄、土槿皮、黄连，且2～5 d均可保持一定的抑藻率，说明这几种材料均有持久抑藻的作用效果；其次是铁观音、大蒜；而大麦茶和仙鹤草在试验期间其抑制率一直小于30%，可认为这两种材料对铜绿微囊藻生长的影响作用不明显。另外，大蒜、大黄在前期抑制率较低，随着时间延长其抑制率增幅较大，可能是由于浸提液中的有效成分需要一定的活化时间后才能发挥抑藻效果；蜜桔等柑橘皮含有丰富的生物活性物质[29]，具有抗菌、抗病毒等作用[30]。柑橘、大蒜、铁观音都是人们常用的食物及饮品，较之土槿皮、黄连更加方便易得，综上而言这几种材料有望作为抑藻剂的制备材料。

为了进一步了解有效抑藻材料的最佳抑藻浓度，本试验采用二倍稀释的方法对铜绿微囊藻进行抑制试验。柑橘皮类水提液对铜绿微囊藻有低促高抑的作用效果，这与梁宇斌等[31]的研究结果类似,脐橙皮提取液有低促高抑的作用效果，在质量浓度为1.66 g/L时对铜绿微囊藻的生长有促进作用，而在3.31、6.62 g/L时对其具有明显的抑制作用。本试验得到的具体结果与之略有不同，可能是由于柑橘种类不同或所产地区不同所致。不同种类的中草药材料对藻的影响可能起抑制作用，也可能起促进作用。刘东超等[32]研究了马齿觅、桔梗、花粉等对亚心形扁藻生长的影响，表明其对亚心形扁藻有一定的促进作用，且作用的最佳质量分数分别为1.50%、0.75%和1.00%。周银环等[33]研究了3种中草药对绿色巴夫藻生长及叶绿素a含量的影响，结果表明添加一定量的当归、桔梗能提高绿色巴夫藻的生长及叶绿素a含量。当归、桔梗属于营养性的药物材料，仙鹤草也属于该类材料，本试验中虽然并未出现促进铜绿微囊藻生长的作用效果，但其抑藻效果并不明显。土槿皮等具有杀菌、抗病毒的作用，本试验中其对铜绿微囊藻的生长具有抑制作用效果。因此，选择合适的抑藻材料对抑藻机制的研究及抑藻剂的研制非常重要。

4 结 论

(1) 从10种材料中筛选出8种有效抑制铜绿微囊藻生长的材料：大黄、黄连、土槿皮、蜜桔皮、马水桔皮、蜜柚皮、铁观音、大蒜，且抑藻的作用效果能够持久。而大麦茶、仙鹤草不能有效抑制铜绿微囊藻的生长。

(2) 蜜桔皮等柑橘皮类水提液在低浓度时促进铜绿微囊藻的生长，具有低促高抑的作用效果。而黄连、土槿皮等药物材料在低浓度时抑制作用较弱。

(3) 由于本试验中的药物材料浸提液本身具有颜色，考虑到应用时对水质环境的影响，各材料抑藻质量浓度如下：蜜桔皮、蜜柚皮水提液为6.25 g/L；马水桔皮水提液为3.13 g/L；铁观音、大黄浸提液及大蒜液为5.000 g/L；土槿皮、黄连提取物浸提液为2.500 g/L。参考文献:

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