犬呼吸道冠状病毒研究进展

肖　园，吕艳丽

(中国农业大学动物医学院，北京 100193)



文献综述

犬呼吸道冠状病毒研究进展

肖园，吕艳丽*

(中国农业大学动物医学院，北京 100193)

犬呼吸道冠状病毒与大家熟悉的肠炎型犬冠状病毒不同，该病毒属于第2群冠状病毒，常见于犬传染性呼吸道疾病的早期，主要侵害上呼吸道并引起轻度呼吸道症状，在临床上易并发与其他呼吸道病原体的混合感染。该病毒最常存在于气管和咽扁桃体，推荐的诊断方法为RT-PCR，治疗主要是防止继发感染，目前尚无针对该病毒的疫苗用于预防此病。为了更加全面和深入地认识该病毒及其所引起的疾病，论文从该病病原学、流行病学、临床症状、病理变化、发病机理、诊断、治疗和预防等方面进行综述。

犬呼吸道冠状病毒；流行病学；临床症状；病理变化；诊断

犬传染性呼吸道疾病(Canine infectious respiratory disease,CIRD)俗称“犬窝咳”，是一种容易在群居犬(例如犬舍、流浪动物中心内的犬)内流行的疾病综合征。其典型临床症状包括咳嗽、鼻流分泌物、呼吸困难等，持续数周后可发展为肺炎，严重者导致死亡。CIRD的暴发往往造成高昂的治疗费用，给犬舍管理者和动物主人带来不小的利益损害[1]。犬呼吸道冠状病毒于2003年被Erles K等[2]首次在英国发现，此后被证明在世界各国广泛流行。

CIRD是多种病原体混合感染的疾病，常见病原体包括犬副流感病毒(Canine parainfluenza virus,CPIV or PIV5)、犬腺病毒2型(Canineadenovirus,CAV-2)、犬疱疹病毒1型(Canine herpesvirus 1,CHV-1)和支气管败血波氏杆菌(Brodetellabronchiseptica,Bb)，针对这些病原体，不少制药公司已经能够提供相应疫苗进行预防。但近年来，一些新出现的病原体开始在CIRD中流行，如犬呼吸道冠状病毒(Canine respiratory coronavirus,CRCoV)、犬肺炎病毒(CnPnV)、犬流感病毒(CIV)、链球菌、犬支原体等，针对这些病原体的疫苗尚未问世，已经使其广泛流行(如H3N2亚型CIV已被证明进入我国[3])，并使得CIRD的发病率较高。CRCoV从发现至今已有10余年，其流行地域越来越广泛，很有可能已进入我国，虽然CRCoV单纯感染造成的危害不大，但容易伴随继发感染，对动物健康造成较大危害。因此，研究犬呼吸道冠状病毒对于进一步了解和防控呼吸道疾病具有重要意义。

1　病原学

冠状病毒属于套式病毒目、冠状病毒科。是一组具有高度变异率的、有囊膜的、单链RNA病毒[4-5]。病毒颗粒大多呈圆形，少数呈多样形，直径80 nm～120 nm，遗传物质为线状单股正链RNA分子。在所有的RNA病毒中，冠状病毒拥有最大的基因组，大小为27.6 kb～31 kb。病毒囊膜中含有3种结构蛋白，分别是纤突蛋白(S)、膜蛋白(M)和小膜蛋白(E)，此外，还有一种蛋白只在第2群冠状病毒中表达，被称为血凝素酶蛋白(HE)。

冠状病毒能够导致人类和动物的呼吸、肠道和神经系统疾病[5]。其组织器官嗜性和临床严重程度取决于基因型特点[6]。2003年发现的SARS-CoV (非典型性肺炎病毒)和2012年发现的MERS-CoV(中东呼吸综合征病毒)均可引起严重的呼吸道损伤，其中MERS-CoV引起疾病的病死率高达36.7%～65.0%[4,7]。而作为同样具有呼吸道组织嗜性的CRCoV，其单纯感染通常只引起轻度的呼吸道症状，且在不并发其他病原微生物感染时不导致死亡。

冠状病毒分为3个群，CRCoV含有HE基因，分类上位于第2群的a亚群。它与临床上常见的引起犬胃肠炎[8]的犬冠状病毒(CCoV)(第1群冠状病毒的a亚群)同源性低，二者在高度保守的聚合酶区域内仅有69%的核苷酸同源性，而在可变区S基因的氨基酸序列同源性则低至21%。CRCoV与同一亚群的牛冠状病毒(BCoV)和人冠状病毒OC43株的核苷酸、氨基酸序列同源性高，其中与BCoV的S基因的氨基酸序列同源性高达96%。

冠状病毒具有高变异率的特点，例如从人类分离的MERS-CoV与从沙特的蝙蝠和单峰驼分离的MERS-CoV基因序列十分接近[9]，证明人类MERS-CoV很可能是由蝙蝠和单峰驼转移到人后发生突变产生的。相似的是，与BCoV相比，CRCoV 4182株在S基因的下游有一编码非结构蛋白的区域发生了突变[10]，该毒株用8.8 ku的非结构蛋白近似代替了BCoV上分子质量为的4.9 ku和4.8 ku的2个蛋白，这些小突变的产生可能是高度相似病毒能在同一宿主内存在的原因。例如，基于BCoV和CRCoV的高度相似性，有学者用BCoV对犬进行攻毒，发现其对犬也有感染性[10]。这一发现在一定程度上支持了CRCoV是BCoV从牛转移到犬之后发生突变而产生的说法[11]。

存在于CRCoV的S基因和E基因之间的区域是最高变的片段，是鉴别不同毒株的依据。

2　流行病学

2003年，Erles K等首次在英国的一家大型流浪动物中心内检测到犬呼吸道冠状病毒。这家动物中心的犬只流动频繁，虽然按规定进行疫苗免疫预防接种，但仍然暴发了流行性的呼吸道疾病。经检测，发现该冠状病毒存在于犬的肺和气管样本中，随之将其命名为犬呼吸道冠状病毒。此次报道后，多地区展开了对CRCoV的调查和监测，并证实了该病毒的广泛存在。

CRCoV具有明显的呼吸道组织嗜性。Mitchell J A等[12-13]以实验室内攻毒犬以及犬舍内自然感染犬为试验材料，尸体剖检后采集样本做RT-PCR检测，发现CRCoV广泛存在于呼吸道组织和呼吸道相关淋巴结组织中，包括气管、腭扁桃体、鼻腔、咽扁桃体、支气管淋巴结、肺的尖叶和膈叶，其中气管和咽扁桃体是CRCoV最易感染和最多存在的部位。

尽管如此，CRCoV在呼吸道组织内的阳性检出率高低还与临床症状的轻重相关。Erles K等[1]将自然感染病例的症状分为四级，即无呼吸道症状、轻度呼吸道症状(咳嗽、鼻分泌物)、中度呼吸道症状(咳嗽、鼻分泌物和食欲不振)和出现支气管肺炎的严重呼吸道症状。RT-PCR检测发现CRCoV最常于出现轻度呼吸道症状的犬的气管中检出，而很少从出现其他三级症状的犬中被检出。在症状严重时不易有CRCoV的检出，其原因可归于两点：第一，随着CIRD的发展，混合感染出现，其他病原体可将大量呼吸道上皮破坏，导致CRCoV难以增殖；第二，在疾病后期，机体的免疫系统已将大量甚至全部该病毒的RNA清除。

如果要在不剖检的情况下检测呼吸道内的CRCoV，也可以使用口咽拭子、口拭子、鼻拭子等，但其检出率不如气管的高[1,14]。

除了呼吸道组织，CRCoV还曾少数几次于脾、肠系膜淋巴结、结肠等组织以及直肠拭子内[12,15]测得阳性。在36只攻毒犬的直肠拭子中，有4只犬的检测结果为阳性，不过这其中有3只犬接种的是一种不能经体外细胞培养的毒株(LU298)，由此，我们会提出这样的问题：CRCoV是否也能引起消化道的损伤？不同的CRCoV毒株是否有不同的组织嗜性？以及使用经细胞系增殖的CRCoV对犬进行攻毒是否会造成直肠拭子检出率的降低[16]？对于这些问题，还需进行更深入的研究。

鉴于CRCoV最常于呼吸道样本中测出，表明其主要通过呼吸道分泌物传播。而这种传播方式使得CRCoV具有强传染性，尤其易在群居犬中高度流行。对血液抗体检测结果显示，几乎100%的犬在进入犬舍3周后呈现CRCoV抗体阳性，而在进入犬舍的第1天，CRCoV抗体阳性率仅为30%[1]。基于此，年龄在2岁～8岁间的犬因为与外界其他犬的接触频繁，所以其病毒阳性率维持在一个较高水平[17]，这正好和CCoV的流行情况相反。

尽管CRCoV在全年都可检出，但有研究表明，其更易于在冬季流行[18]。这一点与CCoV的流行情况相似[19]。

3　临床症状和病理变化

CRCoV感染多见于CIRD的早期，可引起轻度的呼吸道症状，如喷嚏、干咳和鼻流分泌物等[18,20]。免疫力强者也可能不表现症状。该病的潜伏期约在6 d～10 d，在6 d后可通过口咽排毒[12]，排毒期的长短尚不明确。

自然感染CRCoV病例的组织病理变化情况尚无报道，因为自然感染往往是多因素造成，很难将某种病理变化归结于单一病原体。但无可争论的是，CRCoV优先侵害呼吸道尤其是上呼吸道组织。在实验室攻毒试验[12]中，气管病理切片HE染色后镜检，可见呼吸道病变，包括上皮纤毛萎缩变形、排列不整、数量减少，杯状细胞变形甚至中性粒细胞浸润；通过免疫组织化学染色可发现在上皮纤毛和杯状细胞内存在抗原。以上变化在攻毒后3 d～14 d内可清楚观察到，有时还可观察到肺的血管周隙和细支气管周围的淋巴细胞浸润，但这种变化不如上呼吸道出现的变化典型而有意义。

4　发病机理

CRCoV通过呼吸道分泌物传播进入机体后，主要进入到上呼吸道上皮进行繁殖，通过对呼吸道造成一定的损害而致病。

然而在实际临床中，引起呼吸道感染的病原体往往不止一种。例如，幼龄犬常在呼吸道病毒感染的基础上继发细菌性肺炎[21]。为研究CRCoV在CIRD发展中的地位，Priestnall S L等[22]用CRCoV对体外培养的气管组织攻毒，攻毒后72 h内，发现促炎性细胞因子TNF-α、IL-6和趋化因子IL-8的mRNA水平降低，膜免疫功能受到影响。若此发现在体内成立，那么此机制与呼吸道病变机制相结合，将使得机体清除病原体功能进一步受限，进而有利于除CRCoV外的其他病原体在气管上黏附和增殖，导致混合感染。这在理论上证明了CRCoV对CIRD发展的促进作用。作为实践上的支持，Schulz B S 等[23]在一次检测中发现所有CRCoV阳性犬均存在与其他病原体的混合感染；Joffe D J等[24]和Viitanen S J等[25]通过调查研究和数据分析，证明CIRD的发展与CRCoV的感染有一定相关性。

5　诊断

CRCoV感染犬的临床症状并无特异性，而且常出现与其他病原体的混合感染，所以不能只根据临床症状来做诊断。最为合适的方法是取呼吸道样本，针对S基因[1]或者HE基因[15]设计引物并进行套式RT-PCR检测，这种方法具有高度敏感性，可用于检测口咽拭子和鼻拭子等含细胞量低的样本。如果能采集到剖检样本，鼻腔、咽扁桃体、气管、肺也可用于检测。

其次，还有real-time PCR检测方法[13]，此方法的优势是更加快速，并且可以减少套式PCR潜在的污染问题。但其缺点是未能将CRCoV和第1群冠状病毒、第3群冠状病毒区分开来。

如果能采集到发病时的血清和发病后2周～3周的血清，那么血清学检测也不失为一种有用的方法。由于BCoV和CRCoV的高度相似性，ELISA中，可用BCoV抗原检测犬血浆中的抗体[1，14]。

传统的细胞培养分离病毒的方法并不可取，因其目前只能在HRT-18和HRT-18G细胞系中生长[11]，且并不是每次都能成功分离[14-15]。

6　治疗

迄今为止，对于CRCoV的感染尚无特效疗法，可能是由于其单纯感染造成的危害较小，且发病率不高，使得在临床上发展其特异性治疗方法显得没有足够的价值。如果发病，尤其是出现轻度呼吸道症状时，其重点应放在预防和治疗继发的细菌和病毒感染上，因为混合感染可能导致病情迅速恶化甚至死亡。

7　预防

目前尚无针对犬呼吸道冠状病毒的疫苗，针对犬冠状病毒的疫苗不能保护犬免受CRCoV的侵害，因为两种病毒抗原性差异很大。

从预防犬舍、流浪动物中心等场所暴发CIRD的角度看，则该病毒疫苗的研发具有一定必要性。疫苗种类方面，弱毒苗可能较为经典，近来研发的病毒颗粒样疫苗和针对S基因设计的基因工程苗也具有广阔的应用前景[25-28]。

目前，预防传染性呼吸道疾病的一般措施可用于预防犬呼吸道冠状病毒的感染。包括在犬舍暴发呼吸道疾病后进行清扫消毒；经常对犬共用的器具进行消毒；人在接触过患有呼吸道疾病的犬后，应及时洗手并消毒方可接触其他犬只；对新进入犬舍的犬进行隔离2周以上；普通家庭中，亦应将患有呼吸道疾病的犬和其他犬隔离，并做好日常消毒工作。

8　小结

如今，CIRD仍然保持多种病原体致病的特点，并且病原体种类也在不断地变化。因此，在犬发生CIRD时，要做的是用适当的方法鉴定病原体，以及确定不同病原体在CIRD发展中的重要性。对新的病原体CRCoV的鉴定以及其在CIRD中地位的研究，将加深对CIRD的理解，有助于更好地控制。

从全球流行趋势来看，犬呼吸道冠状病毒在我国流行的可能很大。但其流行状况、致病特点等可能与国外有所差异，进行相关研究很有必要。

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Progress on Canine Respiratory Coronavirus

XIAO Yuan,LÜ Yan-li

(College of Veterinary Medicine,China Agricultural University,Beijing,100193,China)

Canine respiratory coronavirus (CRCoV) is unlike the well-known enteric canine coronaviruses (CCoV)，and belongs to group 2 coronaviruses.It is frequently detected at the early stage of canine infectious respiratory disease(CIRD) and mainly damages the upper respiratory tract,leading to mild respiratory symptoms, the co-infection with other respiratory pathogens is easily found in clinic.This virus most often exists in tracheas and pharyngeal tonsils,RT-PCR is the reccommnded method to make diagnosis.As to treatment,the main work is to control secondary infections.Currently,there is no vaccine against the virus to prevent the disease.In order to know CRCoV and the causing disease more completely,the etiology,epidemiology,clinical symptoms,pathological lesions,pathogenesis,diagnosis,treatment and prevention of the disease were reviewed in this paper.

Canine respiratory coronavirus;epidemiology;clinical symptom;pathological lesion;diagnosis

2016-03-26

肖园(1993-)，男，江西赣州人，硕士研究生，主要从事小动物内科学研究。*通讯作者

S852.659.6

A

1007-5038(2016)09-0091-04