非编码RNA在生殖调节中的研究进展

杜琛，徐琰琪，陈秀娟



·综述·

非编码RNA在生殖调节中的研究进展

杜琛，徐琰琪，陈秀娟△

非编码RNA（ncRNAs）在高等生物体内大量存在，组成十分复杂的生物调控网络，是目前生物医学领域的研究热点。小干扰RNA（siRNA）、微小RNA（miRNA）和PIWI相互作用RNA（piRNA）作为细胞内基因调控网络的重要成员影响细胞的各种生命活动。近年研究表明，ncRNA通过沉默转座元件和调控编码基因等方式在生殖细胞发育、分化、凋亡及激素合成的调控过程中发挥重要作用，ncRNA的异常表达与多囊卵巢综合征（PCOS）和卵巢功能早衰（POF）等生殖疾病密切相关。综述ncRNA在卵泡和胚胎发育以及精子生成等方面的作用及其研究进展。

RNA，小分子干扰；微RNAs；生殖细胞；卵巢疾病；非编码RNA；PIWI相互作用RNA

【Abstract】Non-coding RNAs（ncRANs），abounding in higher organisms，form a very complex network of biological regulation，which is the hotspot of biomedicine in recent years.Three kinds of ncRANs，small interfering RNA（siRNA），microRNA（miRNA）and PIWI-interacting RNA（piRNA），are importantmembers of this regulating network.Recent studies showed that ncRNAs play key regulatory roles in the development，differentiation and apoptosis of germ cells during gametogenesis and the steroidogenesis by the machinery silence transposable elements and their regulating effects on the expression of target genes.Ovarian dysfunction such as polycystic ovary syndrome（PCOS）and premature ovarian failure（POF）could be related with the aberrant regulation of ncRNAs.In this paper，we summarized the research progress of ncRNAs in follicular development，spermatogenesis and embryonic development.

【Keywords】RNA，small interfering；MicroRNAs；Germ cells；Ovarian diseases；Non-coding RNA；PIWI-interactingRNA

（JIntReprod Health/Fam Plan，2016，35：344-347）

基金项目：内蒙古自治区自然科学资金（2015BS0802）

作者单位：010050呼和浩特，内蒙古医科大学附属医院妇产科

通信作者：陈秀娟，E-mail：90098687@sina.com

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审校者

生物体内的RNA可以分为两大类：编码RNA和非编码RNA（non-coding RNAs，ncRNAs）。ncRNA是指不翻译成蛋白质但能够调节蛋白质合成的RNA分子片段。大规模的基因表达和芯片研究发现，人类基因组中约有50%的DNA转录为RNA，而其中只有约2%的RNA翻译为蛋白质，剩余的98%为ncRNAs，其分布广泛，组成了十分复杂的生物调控网络，直接参与mRNA降解、翻译阻遏和异染色质的形成等生命过程，对胚胎发育、器官形成和组织分化等基本生命活动有重要的调控作用，并与一些重要疾病（如癌症、神经系统疾病等）有关［1］。至今共发现了三类ncRNA：小干扰RNA（smallinterferingRNA，siRNA）、微小RNA（microRNA，miRNA）和PIWI相互作用RNA（PIWI-interacting RNA，piRNA）。Argonaute（AGO）蛋白家族编码PIWI、PAZ和MID区域，进一步分为Ago 和piwi亚家族［2］。PIWI蛋白主要表达于生殖细胞和与生殖腺相关的体细胞内，在动物生殖发育分化过程中发挥重要作用。生物信息学研究发现真核细胞中约有数千条ncRNAs，这对揭示基因表达调控规律、提高人类疾病防治能力及探索生物进化规律有重要意义［3］。

1　siRNA

siRNA或沉默RNA（silencing RNA），产生于长链互补的双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA），5’端和3’端分别被单磷酸和2’-O-甲基化修饰。通过高通量转录组分析发现哺乳动物可以产生内源性siRNA（endo-siRNA），且主要表达于卵母细胞内，是广泛存在于各种真核生物中重要的内源调控RNA［4］。2007年Sijen等［5］提出次级siRNA（secondary siRNA）是一种特殊的小RNA群体，序列起始于初级siRNA的下游核苷，在表达错配单核苷酸初级siRNA的细胞系中并不复制这种错配，但包含mRNA互补核苷。

Endo-siRNA主要来源于假基因，结合于转座子位点，在体细胞表达很少，主要在卵母细胞和早期植入的胚胎表达，由于其作用的靶标难以确定，研究还在不断探索中［6-7］。最近研究发现在小鼠睾丸生殖细胞中也有siRNA。此外，也可通过多种转染技术将siRNA导入细胞内，对特定基因进行专一性敲除，这使得siRNA成为研究基因功能和药物靶标的一个重要工具。通过siRNA干扰载体转染小鼠睾丸支持细胞，进一步验证尿激酶型纤溶酶原激活因子（uPA）在精子发生、成熟、运动和受精等一系列过程中具有重要作用。Song等［8］研究发现，在小鼠生殖细胞中转染Rhox3干扰载体，小鼠出现精子发生缺陷。微阵列分析发现，造成这种缺陷可不依赖于RHOX3基因的降解，表明转染到小鼠生殖细胞中的干扰载体同时启动了miRNA及endo-siRNA信号机制。在卵母细胞减数分裂的过程中，endo-siRNA与Dicer和Ago2蛋白一样发挥重要作用，两者表达的异常都可造成减数分裂缺陷［9-10］。在敲除dicer和ago2的突变卵母细胞中发现由生物信息学预测的endo-siRNA靶基因Ran-GAP和Ppp4rl的表达量上升2～4倍，并出现纺锤体缺陷，表明endo-siRNA在卵母细胞中对维持细胞骨架有一定作用。

2　m iRNA

miRNA是在真核生物中广泛存在的一类内源性具有调控功能的小分子RNA，根据生物途径不同分为典型miRNA和非典型miRNA。首先转录为原始miRNA转录本（primary transcripts，pri-miRNA）形成分子内茎环结构，之后被DGCR8识别剪切转运至胞质中。miRNA的表达具有时序性和组织特异性，解螺旋后其正义链与AGO和GW182蛋白家族结合后作用于靶mRNA 3’非翻译区（3’UTR），通过翻译促进、翻译抑制和mRNA降解实现对基因的调控［11］。

2.1m iRNA对卵泡发育的影响基因表达分析研究发现miRNA对维持生殖能力和生殖细胞发育分化过程有重要作用。在小鼠2-细胞期敲除Dicer1后，miRNA和endo-siRNA的表达量也随之降低，并出现纺锤体和染色体异常，进一步通过Zp3-Cre敲除Dgcr8基因，发现在卵母细胞中没有任何miRNA的表达，证明miRNA在卵母细胞发育的早期具有重要作用［12］。目前，利用高通量测序技术已构建多个哺乳动物卵巢miRNA表达谱，其表达模式存在着一定的差异性和特异性，且呈现动态变化，有些miRNA在多个物种的卵巢中均有表达，如miR-21、miR-126、miR-143、miR-145及let-7家族等，这些miRNA的靶基因在哺乳动物卵巢中主要涉及细胞周期调控、细胞增殖分化和内分泌系统疾病等信号通路。特定卵巢组织miRNA的研究也陆续开展，如卵母细胞、颗粒细胞和黄体等组织。Assou等［13］利用高通量测序方法研究发现，miR-184、miR-100和miR-10A在女性成熟卵母细胞中的表达量最高，而miR-29a、miR-30d、miR-21和miR-93等则特异性地表达于卵丘细胞中。同年，Sang等［14］在人卵泡液中发现14种高表达的miRNA。对小鼠的研究发现，注射黄体生成激素/人绒毛膜促性腺激素（LH/hCG）后颗粒细胞中miR-132和miR-212的表达量显著升高，表明miRNA是在翻译后水平发挥主要调控功能。卵泡闭锁受一系列旁分泌因子的调控，对小鼠卵巢的研究发现miR-22通过下调沉默信息调节因子1（silent information regulator 1，SIRT1）的表达抑制颗粒细胞的凋亡［15］。miR-93在多囊卵巢综合征（PCOS）患者中高表达，其靶基因DNKN1促进细胞增殖，胰岛素可以促进miR-93的表达，这对PCOS患者颗粒细胞功能障碍的研究提供了新的思路［16］。目前关于miRNA在黄体形成和退化中的研究不多，在小鼠中抑制Dicer1的表达，导致黄体形成受损，不能维持妊娠，miR-17-5P 和let-7b表达下调。

2.2m iRNA对雄性生育能力的影响利用miRNA基因芯片技术及小RNA深度测序技术，发现miRNA在参与精原干细胞分化、精母细胞减数分裂和精子变态过程中发挥重要作用。对比男性不育患者与健康男性精液的miRNA发现，有52个差异miRNA，其中21个miRNA过量高表达，31个miRNA表达水平显著下降［17］。最近研究发现，miR-233可能通过抑制过渡蛋白2（TNP2）及精子发育过程中蛋白质的表达导致精子变形［18］。近年研究发现，miR-17-92基因簇包含6种不同的成熟miRNA，在小鼠中靶向破坏基因簇可导致睾丸严重萎缩，这种表型是由于精原细胞和精原干细胞的数量减少所致。miR-146的表达影响精原细胞转录本的水平，体外研究发现抑制miR-146后，细胞往往不能正常分化为精子，并出现细胞凋亡［19］。miRNA作为内源基因调控因子影响蛋白稳定性，参与精子DNA的损伤应答机制。

3　piRNA

2006年，在果蝇、小鼠、大鼠和人等物种生殖系细胞中发现了一类特异地与PIWI家族蛋白质相互作用的新型小分子RNA，命名为piRNA。piRNA的5’端有很强的尿嘧啶（U）偏好性，3’端被2’-O-Me修饰，以保护其免受核酸外切酶降解［20-21］。piRNA信号通路是另一特殊的RNA干扰机制，由于其序列和分子作用机制的特异性，piRNA主要存在于胚胎、雌性和雄性生殖系中，在精子形成过程中有沉默逆转录转座子的特定作用［22］。小鼠基因组编码3种PIWI蛋白：PIWIL1/MIWI、PIWIL2/MILI和PIWIL4/MIWI2。这3种蛋白主要表达于雄性生殖细胞内，在精子发生过程中呈现连续性和重复性的表达模式。哺乳动物中，piRNA根据表达时间不同分为3类，通过深度测序分析发现这3种piRNA在序列结构上有很大的差异，其来源于不同的染色体位点，呈线性不对称结构。对小鼠、果蝇等物种的研究推测，piRNA分子可能通过“初级加工”和“乒乓循环”途径，在扩增产生大量piRNA的同时，切割了大量来源于转座元件转录产物的piRNA，以维持生殖系自身基因组的稳定性和完整性［23］。

3.1piRNA对生殖功能的影响PIWI通路主要作用于精母细胞减数分裂和单倍体精子形成这两个时期，突变发生在前者导致精母细胞停滞在双线期，染色体联会出现异常，这是由于逆转录转座子活性升高导致全基因DNA损伤。如果突变发生于之后的精子形成时期，其表现没有前者明显。在精子发生过程中piRNA序列发生一系列变化，主要分为前粗线期piRNA，在新出生小鼠的睾丸组织中有较高表达，粗线期piRNA主要表达于精子形成过程中的减数分裂时期［24］。对果蝇的研究发现，突变可以导致星状蛋白（Stellate protein）表达异常，进而影响雄性果蝇的生育能力。敲除su（Ste）后所致的piRNA缺失可以引起星状蛋白水平升高，且显著高于其mRNA的水平，说明piRNA对其调控是通过转录后降解途径发生的。

3.2piRNA对维持生殖干细胞的影响Piwi蛋白是一个表观遗传调控因子，在生殖细胞发育、干细胞自我更新和转座子沉默上具有重要功能。在多细胞生物中，原始生殖细胞是最早分化出来的一群细胞，迁移至生殖嵴后称之为生殖干细胞［25］。在胚胎期睾丸组织中Piwil2/Mili与Piwil4/Miwi2协同作用保护原始生殖细胞的稳定。在果蝇属中首次发现piwi蛋白介导的分子机制不同而出现不同的生物学功能。Tudor结构域蛋白（TSN）有5个结合位点，高表达于胚胎和成体性腺中。小鼠PIWI蛋白突变导致TSN突变，精子发生过程出现异常，减数分裂时期胞质分裂缺陷，最终导致雄性不育［26］。小RNA分子作为“配体”调控其结合蛋白泛素化修饰，为蛋白泛素化修饰提供了全新的调控模式。除了激活干细胞活性相关基因外，piRNA通路能够保护端粒的完整性，而端粒稳定存在是维持干细胞特性的基本条件。

3.3piRNA对卵子发生的影响在果蝇卵巢，piRNA的基因定位于端粒偏中心位置和端粒位点。piRNA作用途径中相关的蛋白发生突变，导致卵子发育受阻。ziwi和zili基因突变的雄性斑马鱼是正常可育的，但该突变会影响雌性斑马鱼卵子发育过程，使卵子停滞在减数分裂1期，导致不孕。然而小鼠在卵母细胞敲除piwi后未出现明显表型，这可能是由于卵子发育在不同物种之间存在差异［27］。在猕猴和牛中发现piRNA在雌性生殖细胞中的功能与在睾丸中相似。最近通过高通量测序得到人类卵母细胞发育和胚胎发生时期PIWIL1、PIWIL2和PIWIL3的动态表达模式［28］。

4　ncRNA与生殖系统疾病

由于miRNA在生殖系统中发挥重要的调控功能，miRNA的缺失或异常表达很可能会导致生殖系统疾病。通过逆转录-定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测到miR-505结合在靶基因转化生长因子（TGF）3’UTR区，其表达量在子宫内膜癌组低于正常组［29］。子宫肌瘤与正常子宫肌层之间miRNA的表达差异明显，且随着肌瘤大小的变化，miRNA表达谱也发生相应的变化。研究发现miR-132和miR-320 在PCOS患者卵巢内的表达量低于正常妇女。miR-93，miR-133，miR-223的靶基因是葡萄糖转运蛋白4 （GLUT4），在PCOS患者组织中的表达量极高。最近研究发现，在PCOS患者卵泡液中有7个miRNA的表达量下调，且参与类固醇的生成，其中miR-132和miR-320参与调节雌二醇，miR-24、miR-193b调控体内孕酮水平。有5个miRNA在PCOS患者卵泡液中过表达，其靶基因胰岛素受体底物2（IRS-2）降低，在小鼠中该基因的降低会导致排卵障碍及不孕［30］。卵巢功能早衰（premature ovarian failure，POF）是指年轻女性出现卵巢功能衰退、闭经，并伴有低雌激素和高促性腺激素状态的一类疾病。研究表明在POF患者中有63个miRNA上调，20个miRNA下调，其中miR-29a和miR-144的表达下降导致前列腺素合成酶类的表达上升，这可能是诱发POF的原因之一［31］。研究发现PIWI蛋白异常高表达与肿瘤恶性程度呈正相关。PIWI蛋白通路在子宫内膜癌、乳腺癌、卵巢癌和宫颈癌等疾病中高表达。一方面由于过度的甲基化，使部分抑癌基因受到抑制，从而发生DNA的错误传递。另一方面激活了其他信号通路抑制细胞凋亡并提高了肿瘤药物的耐药性［32］。ncRNAs在生殖疾病方面的研究已逐步开展，其功能和作用机制也将更加明确，靶向治疗结合化疗药物可能是今后肿瘤基因治疗的新途径。

5　结语

ncRNA在生殖细胞发育的多个过程中起重要作用，参与其信号通路可抑制基因组中移动元件、抵御转座元件对基因组的侵袭和破坏，同时还参与蛋白编码基因的表达。ncRNAs的表达异常也与许多疾病有关，包括PCOS和POF等。进一步研究ncRNAs在生殖调控功能中潜在的生物标志物功能、动态变化及调控机制，有助于发现新的生物指标和靶向治疗位点，为疾病的预防、诊断和治疗提供思路。

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［本文编辑王琳］

Roles of Non-coding RNAs in the Regulation of Reproduction

DU Chen，XU Yan-qi，CHEN Xiu-juan. Department of Obstetrics and Gynecology，Affiliated Hospital，Inner Mongolia Medical University，Hohhot 010050，China

CHEN Xiu-juan，E-mail：90098687@sina.com

（2016-04-20）