线粒体DNA与早期胚胎发育的研究进展

曹亚男，郝建秀，张雯珂，王莉，姚元庆



线粒体DNA与早期胚胎发育的研究进展

曹亚男，郝建秀，张雯珂，王莉，姚元庆△

线粒体是胞质中独特的细胞器，为细胞各种代谢提供能量。线粒体具有自己独立的遗传物质——线粒体DNA（mtDNA），是细胞核基因组外的遗传物质。在早期胚胎发育过程中，线粒体会呈现不同的形态及分布，mtDNA的突变及拷贝数变化会对胚胎发育结局产生重要影响。最新研究表明，线粒体DNA突变增多则mtDNA拷贝数增加；囊胚期mtDNA拷贝数多，则胚胎移植成功率高；反之亦然。尽管进行了染色体形态学和遗传学检查，仍有卵母细胞不能成功受精并发育成完好的胚胎；即使胚胎完好，仍有部分胚胎移植失败。因此，从mtDNA角度探讨提高卵母细胞质量的方法对改善辅助生殖技术中移植成功率具有重要意义。

线粒体；DNA，线粒体；胚胎发育；卵母细胞；生殖技术，辅助

【Abstract】Mitochondria， as one of the most important organelles， provides energy for cellualar events.Mitochondria DNAs （mtDNAs） are a set of the genetic materials except for the nuclear genome. The shape anddistribution of mitochondria vary with the oocyte maturation and early embryo development. The mutations ofmtDNAs and the change of copy number were related to the outcomes of embryonic development. It was found thatthe growing mtDNA mutations caused the increased copy number of mtDNAs， and that the increased copy numberof mtDNAs in blastocyst brought the higher success rate of embryo transfer. It is known that a high proportion ofoocytes can not be successfully fertilized or developed to the high-quality embryos despite being chromosomallyand morphologically normal. Some embryos with morphological high-quality are fail to be implanted successfully.It is important to increase the efficiency of embryo transfer by improving the oocyte quality from the perspective ofmitochondria for the assisted reproductive technology （ART）.

【Keywords】Mitochondria；DNA，Mitochondrial；Embryonic development；Oocytes；Reproductive techniques，assisted

（JInt Reprod Health/FamPlan，2016，35：313-316）

作者单位：100853北京，中国人民解放军总医院妇产科

通信作者：姚元庆，E-mail：yqyao@126.com

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审校者

线粒体是细胞质中含量最丰富的细胞器，为细胞各种代谢提供能量。线粒体有自己独立的遗传物质——线粒体DNA（mtDNA），其是除核基因外唯一的遗传物质。现综述mtDNA对早期胚胎发育的影响，并从线粒体角度介绍改善卵母细胞质量的方法。

1　线粒体与mtDNA

线粒体是细胞质中双层膜细胞器，内膜向内皱褶形成线粒体嵴，产生能量多的细胞，线粒体嵴的数目一般也较多。线粒体有许多功能，其中最主要的是以三磷酸腺苷（ATP）的形式提供能量。区别于体细胞的ATP主要由糖酵解和磷酸戊糖途径产生，线粒体ATP的产生是通过氧化磷酸化（OXPHOS）的过程［1-2］。此外，线粒体与卵母细胞激活、钙振荡、凋亡等生命过程密切相关。

线粒体内含有mtDNA，因此可以独立进行复制、转录和翻译［3］。人的mtDNA分子是1个高度扭曲的双链闭合环状结构，长度约为16.6kb，编码OXPHOS酶复合体的13个蛋白质亚基，以及自身转录翻译所需的22种转运RNA（tRNA）和2种核糖体RNA（rRNA），无内含子［4］，但突变率约是核DNA的20倍［5］。mtDNA的突变及拷贝数变化会对早期胚胎的发育产生重要影响。

2　线粒体及mtDNA与早期胚胎发育

2.1线粒体与早期胚胎发育由于哺乳动物中的线粒体是母系遗传，并且精子所含的线粒体会在受精时消失殆尽［6］，因此MⅡ期的卵母细胞与受精卵含有同一套mtDNA，所以卵母细胞中线粒体的质量和数目会对早期胚胎质量产生重要影响。而在卵母细胞成熟的过程中，线粒体扮演着重要角色。有文献表明线粒体通过在卵母细胞中的分布变化调节ATP的生成，并在限制最低水平活性氧簇（ROS）的条件下，迅速、有效地为细胞“定点”提供能量［7］。葛红山等［8］利用小鼠建立OXPHOS抑制模型，发现线粒体能量缺乏显著降低卵子的核成熟率、ROS生成、纺锤体/染色体结构完整率和囊胚形成率。同时，有研究表明线粒体的功能成熟影响早期胚胎的发育潜能［9］。

在早期胚胎中，线粒体的数目并不增加［10］，但由于胚胎发育所需要的能量增多，所以线粒体不得不通过形态和分布的变化来提高工作效率。例如线粒体形态变得更加复杂、嵴的数目更多、形状更加拉长等，而当细胞分化为滋养外胚层（TE）和内细胞核团（ICM）时这种变化尤为明显［11-12］。

2.2m tDNA与早期胚胎发育

2.2.1mtDNA突变由于mtDNA缺乏类似核基因的修复机制及组蛋白的保护，因此mtDNA突变率更高。目前发现大约有150种线粒体突变，其中约15%

来源于母源性线粒体基因，mtDNA突变会导致线粒体OXPHOS能力降低，从而降低卵母细胞受精率和胚胎发育潜能［13］。有研究检测到人卵母细胞mtDNA 5 286 bp的缺失，并证实这种缺失会降低临床体外受精（IVF）的成功率［14］。尤其是对于高龄妇女，Keefe

等［15］首次发现高龄妇女的卵巢组织、卵子及颗粒细胞出现高的mtDNA 4 977 bp缺失。Seifer等［16］研究显示高龄妇女卵子mtDNA突变率及缺失显著高于年轻妇女。有研究用基因改造工程方法使mtDNA突变累积到9个月时，小鼠出现卵巢功能早衰［17］。这些结果与临床高龄妇女IVF成功率低的事实是相符的。线粒体能量产生过程中释放大量氧自由基，高龄妇女的抗氧化能力下降，自由基减少，ROS堆积，可能是高龄妇女mtDNA突变率高的原因。同时伴随的供能ATP减少，导致卵母细胞减数分裂过程中染色体分离障碍，形成非整倍体胚胎，而非整倍体胚胎是反复种植失败和反复流产的主要原因［18］。由此可知，mtDNA突变对卵母细胞成熟和早期胚胎发育具有重要影响。

2.2.2mtDNA拷贝数卵母细胞线粒体的含量即

mtDNA的拷贝数，已有研究表明在原则上卵母细胞线粒体只含有1个或2个基因组［19］，聚合酶链反应（PCR）技术检测人成熟卵子中mtDNA含量约为

20 000～800 000个拷贝数不等［20］，而且从受精后到移植早期时线粒体总数也不再增加［10，19］。在每次卵裂前，微管都会牵动线粒体均匀分布在原核核周，以保证细胞分裂时线粒体会平均分配［21］。那些没有被均等分配的细胞会发生卵裂球的细胞消融，而这会影响后续胚胎的发育［22］。而且，伴随胚胎发育中细胞的分裂，mtDNA不断地被分到每个细胞中去，直到胚胎发育第5～6天时，每个细胞中含有的mtDNA拷贝数显著少于最初卵母细胞或者受精卵的mtDNA拷贝数。累积在卵母细胞中mtDNA直到囊胚形成时复制才重新启动，因此卵母细胞中mtDNA的含量与受精结局和胚胎发育能力密切相关［23-24］。由于mtDNA拷贝数可以表示卵母细胞中mtDNA的含量［25］，所以，保证受精后胚胎能完成发育的mtDNA拷贝数就是卵母细胞MⅡ期中线粒体的含量［19］。许多研究表明，卵母细胞mtDNA的含量与受精相关［23，26］。Santos等［23］的研究表明，一方面，退化的卵母细胞内mtDNA拷贝数也相对较少；另一方面与受精成功组相比，受精失败组的卵母细胞内mtDNA拷贝数显著减少，但并未证明未受精卵母细胞中低含量的mtDNA导致了受精失败。也有研究认为两者不相关［27］。

尽管有研究表明胚胎从卵裂期到囊胚形成期的发育要靠线粒体维持［28］，但这在一些动物模型实验中却并不成立。在1个线粒体转录因子A敲除的小鼠模型中，卵母细胞中线粒体数目的减少并不影响受精和早期胚胎发育［13］。从生物进化的角度看，如果卵母细胞和胚胎依靠外部的代谢为来源，那么进化就应该赋予胚胎绝对的能增加其营养和氧气交换能力的优势。相反，卵母细胞和早期胚胎形状的特异使其具有很小的表面积并且能量交换能力差，所以，进化赋予其卵母细胞时期累积的线粒体以便提供给胚胎发育所必需的能量。但是，在代谢原料减少等特殊情况下，细胞会反应性地增加mtDNA的拷贝数，试图产生更多的线粒体。

对于早期胚胎中mtDNA与早期胚胎发育的关系，有学者提出早期胚胎中的线粒体含量存在一个阈值，高于阈值时胚胎能正常发育，低于阈值时则导致胚胎发育停滞，如前文所述，过少的线粒体可影响微管的功能，出现纺锤体异常，胚胎染色体倍性发生改变［29］。然而近期研究表明，胚胎中mtDNA拷贝数的增加与代谢性应激有关，而胚胎能通过增加mtDNA的含量来弥补能量的不足。在卵母细胞成熟的过程中，能量应激与先天因素有关，并且对mtDNA突变引起的呼吸链受损做出反应。与此结论一致的一项研究表明，在从胚泡到囊胚发育的过程中，线粒体肌病、脑病等疾病中mtDNA的突变会导致mtDNA拷贝数增加［30］。

目前，已有2项实验室研究证明，整倍体胚胎中含有mtDNA拷贝数多则胚胎移植发育潜力低［31-32］。Diez-Juan等［31］的研究证实了基于mtDNA拷贝数的线粒体评分（Ms）对临床工作是有帮助的。研究者分析了270例单胚胎移植患者的290个整倍体胚胎，第3天胚胎Ms＜34（MsA）的胚胎移植率（IR）是59%（n= 51）；Ms 34～52（MsB）的IR是44%（n=52）；Ms 52～97 （MsC）的IR是42%（n=50）；Ms＞97（MsD）的IR是25% （n=52）；Ms＞160（n=22）不能进行移植。在胚胎发育到第5天时，Ms＜18.19（MsA）的IR是81%，Ms18.19～24.15（MsB）的IR是50%（n=16）；Ms 24.15～50.58 （MsC）的IR是62%（n=16）；Ms＞50.58（MsD）的IR是18%（n=17）；Ms＞60（n=7）不能进行移植。这一结果掀起了mtDNA拷贝数与胚胎发育潜力的新一轮研究，确定能够保证顺利受精和胚胎发育的卵母细胞中mtDNA拷贝数成为至关重要的问题。

综上，mtDNA的突变和拷贝数异常会影响线粒体功能，从而对卵母细胞质量和早期胚胎的发育产生不良影响，而关于卵母细胞发育不同时期的最佳mtDNA拷贝数的问题则尚待进一步研究。

3改善线粒体质量的方法

关于改善线粒体质量的方法，总结起来，可分为线粒体替代治疗和线粒体药物治疗两大类。线粒体替代治疗又包括卵子细胞质移植、原核移植（PNT）、线粒体移植和极体移植。对于异体移植，德克萨斯大学法学院的Robertson［33］认为，即使建立了安全有效的卵子构建方法，还要面对由此引发的伦理问题：①孕母的基因分离；②对捐卵者的影响；③基因组的干扰。线粒体移植和极体移植都属于自体移植，它们避免了异体移植的缺点，并逐渐成为近来研究的热点。线粒体药物治疗有生长激素（GH）辅助治疗、辅酶Q10等。

4展望

众所周知，随着糖尿病、肥胖症、高龄不孕女性的日益增多，越来越多的患者借助辅助生殖技术生育，但胚胎移植成功率一直不很理想，尽管进行了染色体形态学和遗传学检查，仍有卵母细胞不能成功地发育成完好的胚胎，即使胚胎完好，多数也会以移植失败而告终。究其原因，是没有充分考虑人类胚胎发育能力的能量供应问题［34］。目前对线粒体基因组测序的主要方法有第一代基因测序技术、PCR技术、第二代基因测序技术，以及滚环扩增技术和线粒体间接测序，每种方法各有利弊［35］。由于mtDNA对早期胚胎发育的重要影响，实现利用已建立的各种方法对更大样本以及多中心的mtDNA拷贝数阈值确定的研究已成当务之急！

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［本文编辑王昕］

Research Progress of Mitochondrial DNA in Early Embryo Development

CAO Ya-nan，HAO Jian -xiu，ZHANG Wen-ke，WANG Li，YAO Yuan-qing. Department of Obstetrics and Gynecology，Chinese PLA GeneralHospital，Beijing 100853，China

YAO Yuan-qing，E-mail：yqyao@126.com

（2016-03-23）