连接蛋白43调控成骨细胞分子机制

刘刚　薄占东

530000　南宁，　　广西医科大学第一附属医院骨关节外科



连接蛋白43调控成骨细胞分子机制

刘刚薄占东

530000南宁，广西医科大学第一附属医院骨关节外科

摘要连接蛋白43(CX43)是骨细胞中表达最多的缝隙连接蛋白，由CX43构成的缝隙连接或半通道在骨细胞间通讯中发挥至关重要的作用。大量研究表明，CX43可影响骨细胞、成骨细胞的功能，最终影响骨骼的发育和塑形。然而，关于CX43调控骨的分子机制研究较少。该文就CX43调控成骨细胞分子机制作一综述。

关键词连接蛋白43；骨细胞；成骨细胞；信号转导

骨骼的正常发育和维持依赖于骨原细胞、成骨细胞、骨细胞和破骨细胞间的紧密协同作用。在构建和维持骨骼系统时，为了实现骨骼系统结构的完整性、机械能力和骨内矿物质平衡，4种细胞间的通讯不可或缺。研究发现，成骨细胞、破骨细胞和骨细胞之间存在一种直接信号通道，即缝隙连接。缝隙连接是一种跨膜通道，由细胞膜中连接蛋白单体排列成的六聚体(半通道)与相邻细胞膜中的相似六聚体配对而成，进而在两细胞间形成亲水性通道，相邻细胞间的离子、小分子代谢物和第二信使等物质可经其进行自由扩散，从而实现相邻细胞间的信号转导[1]。Jordan等[2]研究发现，连接蛋白43(CX43)主要在细胞核周围表达，在成骨细胞和骨细胞的非交界质膜处也有表达，这种亚细胞定位提示骨中的CX43可能不仅作为缝隙连接通道起作用。Gonzalez-Nieto等[3]研究证实，在细胞液与胞外环境间的物质交换过程中，缝隙连接还可作为半通道起作用。近期研究[4]发现，CX43蛋白C末端可与蛋白激酶结合，主动参与信号转导过程而发挥作用。

1CX43与骨骼疾病

研究[5]表明，人类GJA1基因突变可导致眼齿指发育不良(ODDD，一种以管状长骨增宽、颅面骨畸形及中节指骨发育不良或并指为特征的骨骼疾病)。研究[6-7]证实，在小鼠ODDD模型中GJA1基因突变可引起骨骼几何结构、骨微结构改变和骨量缺失。全部或部分敲除小鼠成骨细胞系GJA1基因后，小鼠表现出骨细胞分化延迟、骨质疏松及与ODDD患者相同的骨骼结构(如长骨周长增大伴骨髓腔扩大和皮质骨变薄)[8]，这种骨髓腔扩大和皮质变薄的表现与老龄及骨病患者骨表型极为相似[9]。此外，GJA1基因突变还可引起与ODDD骨表型不同的颅骨干骺端发育不良[10]。

2CX43与成骨细胞分化及骨形成

CX43可通过调控成骨细胞分化、骨细胞活动来调节骨形成和重塑，也可调控某些因子如核因子-κ B受体活化因子配体(RANKL)、骨保护素(OPG)的表达来调节骨重吸收。Lecanda等[11]建立CX43缺陷小鼠模型发现，模型组中轴骨和四肢骨骨化明显延迟，颅面骨畸形，从这些小鼠长骨和颅骨分离出的成骨细胞某些成骨基因表达减少，骨化延迟。此外，由CX43缺陷小鼠分离的成骨细胞或过表达CX45的成骨细胞系中，成骨标志性物质(如骨钙素、Ⅰ型胶原α1、骨桥蛋白和Runx1)减少[12-13]。Loiselle等[14]建立小鼠CX43缺陷伴有股骨骨折模型，发现CX43可促进骨折愈合。

CX43调控骨细胞功能和骨质量的机制非常复杂，在不同条件下会产生不同的作用。CX43不仅可以传导骨合成代谢信号，还可传导骨分解代谢信号，这取决于年龄、负荷状态，甚至其位置(骨膜或骨内膜表面)[15]。CX43缺陷会降低力学负荷刺激引起的合成代谢效应，还会钝化去负荷甚至高龄引起的骨丢失[16-17]。 在CX43 fl/fl、Dermol-Cre小鼠软骨母细胞中，缺乏CX43可致使全身骨骼骨矿物质密度降低和皮质骨变薄[9]；早期成骨细胞CX43缺陷只表现出骨体积、骨量和骨细胞数目轻微减少[12]。去除成熟骨细胞和成骨细胞中的CX43所导致的骨矿物质密度变化几乎不能用双能X线骨密度测定法区别，而利用显微CT仅检测到股骨皮质密度轻度降低[18-19]。

3骨组织中CX43信号转导分子机制

包埋于骨基质中的骨细胞、成骨细胞和破骨细胞经CX43缝隙连接通道来协调相互间的功能，使骨骼对刺激产生精确的成骨和破骨反应[20]。目前关于CX43调节成骨细胞分化的具体分子机制尚未明确。Niger等[21-22]研究证实，有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK)/细胞外调节蛋白激酶(ERK)及蛋白激酶C(PKC)信号转导通路位于CX43下游，CX43高表达可激活MAPK/ERK及PKC，从而促进成骨细胞分化相关基因的转录；反之，则抑制MAPK/ERK及PKC信号转导通路，成骨相关基因转录减少。也有研究[23]认为，CX43信号转导与Wnt经典信号转导通路相关，其可促进β-连环蛋白(β-catenin)累积、激活成骨分化和增加骨矿化。Wnt经典信号转导通路的激活又可促进CX43表达[24]。

3.1CX43与骨合成代谢信号转导通路

CX43调控成骨细胞分化和基因表达与转录因子Runx2和Osterix(Sp7)有关，而这两个转录因子是骨形成的主要调控因子。在MC3T3-E1成骨细胞中，CX43过表达可增强Runx2报告基因的转录活性；相反，利用siRNA干扰CX43表达，Runx2依赖性转录则受到抑制[25]。CX43主要通过调节其下游PKC家族δ亚型(PKCδ)和ERK来调节Runx2的转录活性，在PKCδ转移至细胞核内之前，其与CX43的C末端结合，调节Runx2的转录[26-27]。当用药物抑制细胞间缝隙连接通讯或低密度培养细胞时，CX43对Runx2的作用减弱甚至消失；高密度培养时CX43才对Runx2发挥作用[22]。因此，在这一调节过程中，CX43是作为经典缝隙连接通道而非其他功能如半通道发挥作用的。此外，成骨细胞中的Sp7也是CX43下游信号转导通路的靶蛋白。在cKOTW2小鼠模型中，3月龄小鼠股骨中的Sp7 mRNA较对照组降低40%[9]。这一现象是继发于Runx2转录活性降低还是CX43直接调节Sp7所致，至今仍不明了。

GJA1基因功能获得性突变或功能缺失性突变可影响斑马鱼鳍片的长短，分别引起长鳍和短鳍表型[28-29]。进一步研究表明，CX43可调节影响鳍片生长的关键分泌因子脑信号蛋白3d(Sema 3d)的表达，Sema 3d再经丛蛋白A3(Plexin A3)和神经纤毛蛋白-2a(NRP-2a)转导信号，依次调控关节形成和骨细胞增殖，最终影响鳍长和骨形态发生[30]。这表明在鳍片生长过程中，Sema 3d是CX43下游的关键靶蛋白。

3.2CX43调控骨细胞凋亡和存活

在多种骨代谢性疾病中，骨细胞凋亡增多[31]。骨细胞凋亡增多可损害骨细胞对力学刺激的反应和细胞间信号转导功能，导致骨吸收增加和骨质量降低[32]，以及破骨细胞形成增多，进而引起皮质骨重吸收增多。

在cKOhOC老鼠模型中，应用原位末端标记法检测股骨干皮质骨中骨细胞的凋亡情况，结果显示模型组凋亡骨细胞阳性率是对照组的2倍，空骨陷窝数是对照组的6倍[8]。应用shRNA敲除MLOY4骨细胞样细胞的GJA1基因后，细胞生存能力降低，同时破骨细胞分化因子如RANKL增多，OPG表达下降[8,33]，破骨细胞形成增多。

研究[19,33]表明，甲状旁腺激素(PTH)和双膦酸盐化合物发挥抗凋亡作用时都需要CX43的参与；CX43的C末端可与β-抑制蛋白结合，有效地将β-抑制蛋白与甲状旁腺激素受体(PTHR)1隔开，使得PTHR1可以持续发挥作用，同时细胞内环磷酸腺苷(cAMP)积累，从而增强骨细胞存活能力。双膦酸盐化合物是骨重吸收的强烈抑制剂，其主要药理作用是抑制破骨细胞的功能和存活[34]。研究发现，双膦酸盐化合物可与细胞表面的磷酸酶结合[35-36]，磷酸酶再作用于CX43，引起CX43半通道开放，接触激活Src/ERK信号级联，抑制促凋亡蛋白Bad，激活CAAT/增强子结合蛋白β(C/EBPβ)的抗凋亡作用，从而抑制细胞凋亡，促进成骨细胞和骨细胞存活[19,37]。

3.3CX43与机械力传导

机械应力是调节骨合成和分解代谢的重要因素。利用剪切力刺激体外活骨可产生 CX43依赖性钙波[38-39]，提示在骨细胞通过缝隙连接传导机械力信号时，钙离子或钙信号效应器(如三磷酸肌醇)可能作为第二信使发挥作用。在MLO-Y4骨样细胞中，流体剪切应力可使α5β1-整合素磷酸化、构象改变，然后与CX43的C末端物理性接触，使CX43半通道开放，前列腺素E2(PGE2)由半通道释放，PGE2信号通过其同源的EP2/4受体引起磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路活化和cAMP累积[40],促进骨细胞存活。而cAMP/PKA和PI3K/AKT通路都汇聚至β-catenin[41]，从而活化Wnt/β-catenin信号转导通路，促进β-catenin累积，激活成骨分化，增加骨的矿化。

综上所述，CX43在调节骨细胞功能、信号转导、基因表达、骨细胞存活和凋亡以及机械传导方面均发挥着至关重要的作用。CX43不仅可作为缝隙连接蛋白发挥作用(CX43高表达，可激活MAPK/ERK及PKCδ，促进成骨细胞分化相关基因如Runx2、Sp7的转录)，还可作为半通道发挥作用(CX43半通道与其他蛋白如磷酸酶、整合素等相互作用，使其开放，释放PGE2，从而活化Wnt/β-catenin信号转导通路，促进β-catenin的累积，激活成骨分化，增加骨的矿化)。相反，CX43的低表达可使成骨细胞分化延迟，进而影响骨骼发育与塑性，最终导致骨骼畸形。然而，CX43发挥功能的途径多而复杂，目前有关CX43调节成骨细胞分化的具体分子机制尚不十分清楚，通过CX43传递信息的第二信使与细胞功能之间的相互关系也需进一步明确。明确CX43调节骨内稳态及对机械刺激、激素信号反应的具体分子机制，可为某些骨骼疾病提供新的分子标志物，为其治疗提供新靶点。

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(收稿：2015-06-03; 修回：2015-10-28)

(本文编辑：卢千语)

DOI：10.3969/j.issn.1673-7083.2016.01.010

通信作者：薄占东E-mail： zdb71718@163.com

基金项目：国家自然科学基金(81460348)、广西教育厅一般项目(2013YB314)