精子DNA碎片与精液常规参数的相关性研究进展

王志强　杨杰　葛君　陕文生



·综述与讲座·

精子DNA碎片与精液常规参数的相关性研究进展

王志强杨杰葛君陕文生

男性不育诊断的第一步传统上采用精液常规检查，但是，该检查在判断引起该疾病的潜在机制方面存在明显的局限性。精子DNA碎片可能是生育障碍的致病因素，其评估已被建议作为男性不育实验室检查的辅助项目，尤其是在应用辅助生殖技术(ART)之前。通过对近期文献进行回顾，旨在评估精液常规参数和精子DNA碎片检查作为诊断男性不育手段时，两者间可能相关性。

辅助生殖；精液常规参数；DNA碎片

精液常规分析无论过去还是现在都是男性不育初步评估的基础实验室检查项目[1]。尽管该检查并不完善，但是严格的方法学指导及质量控制下进行，精液常规分析可针对男性生育能力提供有用信息。某些患者，初步的精液检查可以揭示精子功能障碍的一些基本形式，如弱精子症或畸形精子症[2]，这对自然妊娠有严重的不利影响。然而，传统精子的诊断能力仍存在局限性，据估计，基本精液分析图正常的男性有15%患有不育[3]。显然，我们需要采取更为精确的测试，以准确判断男性不育的功能性病因及其与生殖结局的关系。许多近期研究证实，精子DNA完整性是正常受精以及父系遗传信息传递给子代的先决条件。因此，该技术可引进为实验室常规检查，可以丰富有关精液功能相关特征的诊断[4]。本文的目的是探讨精子DNA完整性检测与精液常规参数检测的相关性以及临床意义。根据实验室和临床评估精子DNA完整性检测的诊断能力，并针对需要辅助生殖的夫妻，得出该检测用于其有效治疗的价值和实用性。

1　精液常规分析

精液显微镜检查是一种检测男性生育能力的基本方法，但近几年，精液常规分析被认为“过时”，其诊断能力遭遇挑战，尤其是在先进的辅助生殖技术(ART)诞生之后，如卵母细胞胞浆内单精子注射(ICSI)。但是，大部分男科专家仍一致认为基本精液分析目前和将来都是男性不育初步评估最必不可少的项目。根据美国泌尿协会(AUA)和美国生殖医学会(ASRM)的建议，完整的男性不育初步评估应包含综合病史及生育史的记录、体格检查以及至少两项精液分析[5]。

WHO于2010年发布了最新的第5版《人精液检查与处理的实验室手册》，该版本对之前的4个版本进行了充分修订。新版手册提供了详细的方法描述及其局限性[6]，包括替代选项，即实验室可根据特殊需要选择应用的检测项目。应重视检测过程中的质量控制以确保其谨慎性，以公认的指南为依据，采用标准操作流程[7]。更重要的是，新版WHO手册创新的基本特征是引入了再评估和支持基本精液参数参考值的循证数据。尽管WHO手册新提出的指南对精液参数的标准化和评估有重要意义，但是精液分析结果的诊断解释仍需科学审查。

精液常规参数所获取的信息在一定程度上反映了精子发生过程的质量，而该过程决定了精子的功能强弱以及精子的受精潜能。精子浓度、活力以及形态与体内体外受精率具有相关性。

一项或多项精液参数偏离参考值提示可能为男性因素导致夫妻的不孕不育问题[8]。几种不育问题与精子质量异常有关，如精子形态异常，头部畸形的精子数量增多，常可导致复发性流产[9]。但是，低于参考值的精液参数并不能排除体内妊娠的可能性，或者与之相反，“正常”的精子常规参数报告也并不一定能够保证让人满意的受精能力。

由于评估方法存在内在的局限性，精液标本多变的性质，以及不同精液实验室进行检查的能力水平不同，临床上用对生殖结局进行评估时，可生育的男性与不能生育的男性可能存在部分重叠[10]。这可能是由于常规分析无法揭示男性生育障碍的潜在机制。为了丰富基本评估的诊断价值，有必要采取更专业的测试，在分子水平测定精子的功能完整性。越来越多的证据表明，精子DNA损伤与不良临床结局具有相关性，精子染色质完整性检查有望成为实验男科学的新型、有价值的诊断工具[11]。

2　精子基因完整性评估

2.1精子染色质的分子结构精子染色质为有序、紧密的晶体结构，由单倍体DNA和异构蛋白组成。高度浓缩以及不溶性在父系遗传信息通过男性和女性生殖道时起保护作用，并使遗传信息可以保存在精核极小的体积内[12]。Ward等[13]提出的模型描述了精子染色质的结构，由DNA长链起始，随后在4个水平被逐渐包装：染色体锚定，即DNA附着于核环；DNA附着于核基质，形成DNA环状结构域；组蛋白被精蛋白替代，将DNA压缩成致密的“甜甜圈”样构型及染色体结构。

精子DNA与蛋白质相互作用形成的致密复合物构成高度稳定且具有转录惰性的染色质。精子发生和附睾转运过程中，组蛋白大部分(85%)被过转换蛋白(TPs)替代，随后被精蛋白替代。保留下来的15%组蛋白结合DNA位于对早期胚胎发育有重要遗传作用的区域，如启动子、印迹位点和microRNAs[14]。精蛋白为高度碱性的蛋白质，大小为典型组蛋白的一半。人体内已发现两种精蛋白(P1和P2)，而其他动物体内仅有P1。

2.2诱导精子DNA损伤的机制精子核凝聚过程中发生一系列事件，包括拓扑重排、DNA结合蛋白转换、转录改变以及核小体结构丧失。核酸内切酶被认为可以在精子发生中期制造和连接DNA链上的缺口，但是成熟精子内正常情况下并无核酸内切酶。据推测，TPs有修复短暂性DNA缺口的作用，以预防射精的成熟精子发生持续性DNA损伤[15]。此外，精子在分子水平对胚胎有任何表观遗传机制的变动，如选择性组蛋白保留、组蛋白修饰、转录因子、蛋白酶体组成以及DNA甲基化，都可能阻止父亲的基因组向卵母细胞的有限传递，从而妨碍精子功能。

染色质构型的形成过程中各阶段发生改变均可能对精子功能产生不利影响。精子DNA损伤的发生主要与以下机制有关：(1)减数分裂I期凋亡失败导致射出的精子存在缺陷；(2)精子发生期间染色质凝聚缺陷，包括精蛋白化缺陷和染色质包装不充分[16]；(3)睾丸后氧化应激，主要由内外活性氧(ROS)和抗氧化能力不平衡导致[17]；(4)内源性半胱天冬酶和核酸内切酶活性诱导的碎片；(5)各种病理性医源性和环境因素，包括癌症、抗肿瘤药物、精索静脉曲张、高温、白细胞精子症，有毒物质的职业暴露，如胺甲萘，空气污染以及男性年龄增长[18]。此外，不育男性患者的精子DNA碎片与遗传因素有关。基因的变异性与多态性在基因组完整性、减数分裂重组以及配子发生的调节过程中起关键作用，即错配修复途径[19]、解毒途径[20]和抗氧化保护[21]与精子DNA碎片风险增加有关。染色体结构重排，如相互易位和罗伯逊易位，臂间倒位以及染色体畸变，即Yq基因微缺失，与不育男性患者对精子DNA完整性减弱的易感性增加有关。这些因素的不利作用可能相互联系。例如，精子发生过程中的功能机制障碍，如染色质压缩不良，可能导致所产生的精子后期对氧化应激更为易感，从而对精子DNA完整性造成不利影响[22]。

3　精子DNA碎片与实验室及临床的相关性

3.1与精液常规参数的相关性过去几年中，几项研究尝试探讨精子DNA碎片与常规精子参数之间的相关性，但未得出明确结论。大部分研究指出，DNA碎片率与精子质量呈负相关，其中精子质量以精子浓度、活率、活力以及形态为标准进行评估，而不考虑研究对象的年龄[23]。

形态正常的精子百分比与DNA碎片呈显著负相关[24]。染色质结构异常和DNA链断裂与形态严重异常相关，如巨头、多尾畸形精子与二体同时存在，或发生伴异倍体率增高的圆头精子症。此外，特定的形态异常，如锥形头，在DNA碎片增多的患者中无法解释与复发性流产有关。头部异常小的精子其体外受精(IVF)预后较差，且与高水平DNA碎片有关[25]。

相反，有几项研究报道没有发现传统精液参数(如精子浓度、运动性和形态)与DNA碎片指数存在显著相关性[26]。但是，根据WHO标准具有正常特征的精子也存在遗传物质受损[27]。与之不同的是，在一些特定的患者，如易位携带者和癌症患者，精子染色体畸变并不总是伴随精液特征(如正常形态精子百分比)异常[28]。

不同研究在精液常规参数与DNA碎片指数的相关性方面存在争议，其可能原因如下：(1)用于测定DNA完整性的方法不同：多数研究采用不同方法评估DNA碎片，因此常常检测DNA损伤的不同方面，而且结果并不一定具有可比性。(2)精液常规参数分析方法和标准不同：精子计数以及形态评估所采用的技术不同可能影响结果的准确性。此外，各实验室依据的指南(如WHO 1999或WHO 2010手册)可能并不一致，从而导致界定“正常”的参考值较为混乱。(3)精液参数测定的质量控制：精液分析研究很少提及实验室进行测定时是否为了保证结果的精确性，减少主观性而采用了外部质量控制。(4)研究人群的选择标准缺乏一致性：各患者亚组所得出的结果并不一定具有可比性[25]。

3.2与临床参数的相关性精子DNA损伤可能在生殖过程的不同阶段发挥作用，从胚胎的着床前发育开始，到实现并维持妊娠，最后分娩健康子女。精子DNA损伤在生育的不同时间点均有影响，与以下临床终点具有相关性：受精率、胚胎发育、着床、妊娠和流产率以及后代先天性异常。

关于精子DNA碎片对受精率是否有影响的确存在一些争议。受精结果与高水平精子DNA碎片呈负相关[29]。但是，如果DNA损伤的类型和程度可被卵母细胞的修复能力所平衡，那么即使精子DNA碎片率升高，仍可能实现受精。这在行ART的患者中尤为明显，特别是ICSI，受精率与精子DNA碎片或异常DNA凝聚的发生率似乎并无相关性[26]。

在精子DNA质量受损的患者，胚胎可能出现凋亡和碎片，难以到达囊胚期。这在行ART(IVF和ICSI)的患者中较为明显，基因组异常的精子可能对胚胎造成不可修复的损伤，导致胚胎发育停滞在囊胚期之前，且着床率较低[30]。

大量研究证实，精子DNA碎片程度增加对实现并维持妊娠有不利影响。复发性流产与多种基因组异常有关，包括精子DNA碎片。根据IVF和ICSI数据，DNA碎片程度增加时流产风险增加4倍。

在复发性流产的夫妻中，非整倍体率与精子DNA碎片存在明显相关性。相关研究表明，对于这类患者，非整倍体和DNA碎片呈相关性，提示精子发生过程中利用细胞凋亡的检查点机制存在缺陷。这项观察在由严重睾丸损伤或输精管部分堵塞导致的严重少精子症患者中也得到证实[31]。

尽管发生DNA损伤的精子引起受精和妊娠的能力下降，但是也不排除可能得到让人满意的结果，尤其是在ICSI的辅助下。对于这些病例，其下一代的健康是否会受到影响目前尚不明确。

职业暴露(金属、溶剂、农药或烟)导致的父系DNA损伤与先天缺陷、儿童疾病甚至癌症有关。近几年，高龄且存在精子DNA高度损伤的男性，其子女中遗传病的发生率增高，如精神分裂症、软骨发育不全以及Apert氏综合征。

精子DNA损伤可以认为是一种“冰山效应”，它在射精的所有精子中以不同程度存在，而且对卵母细胞和胚胎的修复能力进行一般描述也存在局限性，因此应用有创性ART(如ICSI)时应注意存在的风险。毫无疑问，尽管需要进一步的随访研究，但是后代中与精DNA质量相关的发病率其严重性仍值得我们注意。

将精子DNA损伤测试完全用于常规临床工作仍需大规模临床试验。确定不育患者中哪些特定人群可从该项测试中获益是一种更为现实的途径。特发性不育的男性，进行过放化疗的癌症患者，男性染色体结构异常携带者，ART妊娠率较低以及胚胎质量差的不育男性，严重形态异常，即多态畸形精子症、圆头精子症[32]，存在引起DNA损伤的潜在因素，如精索静脉曲张、反复ART失败、流产、炎症或生殖道感染。

对于特定患者，DNA损伤的详细信息联合精液常规评估可在ART前评估，包括完整病史评估、临床检查以及女性因素调查的综合精液学检查决定了其步骤。如果评估发现了病理机制，如精索静脉曲张或白细胞精子症，应进行治疗，即手术治疗或抗菌治疗，然后复查精液分析和DNA碎片评估。如果ART失败，尽管多次精液分析均为正常，且不存在女性病理因素，也应进行精子DNA碎片评估。DNA碎片程度增加需要经验性治疗，如补充抗氧化剂或调整生活方式，以减少可能发生的氧化应激相关损伤。

Aitken认为，“常规精液评估的发明永远代表了男性生育功能评估的基础”[33]。这显然是正确的，因为精液分析按照公认的方法在严格的质量控制下进行。鉴于过去几十年中越来越多的科学数据表明，精子完整性对男性生殖能力有非常重要的意义，因此对精子DNA损伤进行详细的标准化检查可合理地用于不孕不育夫妻的综合检查。当然，下列各项问题仍有待解决以达成共识：最佳检查的选择、操作方法以及最重要的决定结果的临床相关性及诊断价值的阈值。

总之，用于诊断男性不育的整体分析今后将在于对精液常规参数和精子基因组完整性的信息进行有效结合。需要进行有目的的大规模研究，对确定具体特质及参考值的变量进行标准化，以辅助优化特定类型男性不育的诊断、治疗和预防。

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项目来源：甘肃省中医药管理局科研项目(编号：GZK-2014-48)