促丝裂原激活蛋白激酶在牙髓干细胞向成牙本质细胞分化和牙髓损伤修复中的作用

林颖秦伟邹瑞林正梅.中山大学光华口腔医学院•附属口腔医院牙体牙髓病科 广东省口腔医学重点实验室 广州 50055；.广州医科大学附属口腔医院•广州口腔病研究所•口腔医学重点实验室 广州 5040



促丝裂原激活蛋白激酶在牙髓干细胞向成牙本质细胞分化和牙髓损伤修复中的作用

林颖1秦伟1邹瑞2林正梅1
1.中山大学光华口腔医学院•附属口腔医院牙体牙髓病科 广东省口腔医学重点实验室 广州 510055；
2.广州医科大学附属口腔医院•广州口腔病研究所•口腔医学重点实验室 广州 510140

［摘要］通过诱导牙髓干细胞（DPSC）向成牙本质细胞方向分化，龋源性牙髓炎的治疗将不再局限于根管治疗这一临床选择，修复治疗也不再成为缺失牙治疗的唯一方案。促丝裂原激活蛋白激酶（MAPK），尤其是P38MAPK通过直接或间接磷酸化特定的转录因子，将细胞外刺激信号转导至细胞及其核内，从而引起一系列细胞生物学反应，如细胞增殖、分化、转化和程序性死亡。骨形态发生蛋白-2、矿物三氧化物聚合体和Biodentine皆可诱导DPSC向成牙本质细胞分化，而三者正是通过MAPK信号转导通路发挥作用的。在组织工程支架诱导DPSC分化过程中，支架材料通过激活P38MAPK信号转导通路促进了DPSC的分化。此外，MAPK信号转导通路参与牙髓损伤修复中DPSC的迁移、黏附和分化，参与牙髓损伤修复中牙本质的形成。由于MAPK信号转导通路在细胞增殖、分化和生存等过程中都起着十分关键的作用，因此，深入研究其反应分子、作用底物和作用机制有着重要的理论和临床意义。

［关键词］促丝裂原激活蛋白激酶；牙髓干细胞；信号转导通路；细胞分化

牙髓干细胞（dental pulp stem cell，DPSC）是一类形态呈梭形、可自我更新、多向分化和有较强克隆能力的牙髓细胞，于2000年从牙髓中分离并命名［1-2］。DPSC源于神经嵴和间质细胞群［3］，这两个细胞群都具有多向分化的功能，在不同诱导剂的作用下，可分化为成牙本质细胞、脂肪细胞和神经样细胞等多种细胞［4-6］。其中，诱导DPSC向成牙本质细胞方向分化的潜在应用价值非常巨大：龋源性牙髓炎的治疗，将不再局限于根管治疗这一临床选择，而是在充分清除感染的前提下，通过体内诱导DPSC向成牙本质细胞分化，促进修复性牙本质的形成；修复治疗也不再成为缺失牙治疗的唯一方案，DPSC研究的深入将为牙组织工程研究带来突破性的进展。同时，随着DPSC的分离、鉴定与培养技术的成熟，上述展望将逐步成为可能。

目前，DPSC向成牙本质细胞分化的具体机制尚不清楚，国内外学者的研究方向主要集中其基因组学、蛋白质组学、表观遗传学、离子通道和信号转导通路等方面。

1　促丝裂原激活蛋白激酶

细胞对环境变化的反应部分是由一系列胞内信号转导通路来诱导的，细胞信号转导通路接替、放大并整合来自细胞外的刺激信号，最终导致细胞的基因和生理改变。促丝裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。在哺乳动物机体中，至少有4种不同的MAPK信号转导通路：细胞外信号调节激酶（extracellular signalregulated kinase，ERK）1/2/5、c-Jun N-末端激酶（c-Jun NH2-terminal kinase，JNK）1/2/3、P38α/β/ γ/δ等。MAPK信号转导通路存在于大多数细胞内，将胞外刺激信号转导至细胞及其核内并引起细胞生物学反应，如细胞增殖、分化、转化和程序性死亡等［7］。MAPK信号转导通路在细胞内具有生物进化的高度保守性，在低等原核细胞和高等哺乳类细胞内，均存在着多条并行的MAPK信号转导通路，不同的细胞外刺激可使用不同的MAPK信号转导通路，通过其相互调控而介导不同的细胞生物学反应［8］。

2　MAPK在DPSC向成牙本质细胞分化过程中的作用

有许多互相作用的信号转导通路参与到DPSC向成牙本质细胞分化的过程中［9-10］，MAPK信号转导通路，尤其是P38MAPK信号转导通路参与了DPSC向成牙本质细胞分化的进程中。Qin等［11］在研究过程中发现，在体外试验中，骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）-2可呈剂量和时间依赖性地诱导磷酸化的P38MAPK水平增加，P38MAPK抑制剂明显抑制碱性磷酸酶活性和成牙本质样细胞的分化，同时降低了矿化结节的形成。这表明P38MAPK信号转导通路在BMP-2诱导DPSC向成牙本质细胞样细胞分化中起重要的信号转导作用。他们经过分析后认为，P38MAPK信号转导通路很可能是通过直接或间接磷酸化特定的转录因子将信号转导到细胞内的，当这些转录因子被P38MAPK或者其下游激酶磷酸化时，它们的反式激活能力会增加，DNA结合亲和力会激活，从而使那些激活以及维持成牙本质细胞分化的特定基因表达增强。

目前，许多充填材料被应用到牙髓病的研究和临床治疗当中，以信号转导通路作为靶点进行疾病治疗是目前业界研究的热点。矿物三氧化物聚合体（mineral trioxide aggregate，MTA）已被证实可以诱导DPSC向成牙本质细胞分化。Zhao等［12］发现，MTA正是通过MAPK信号转导通路发挥作用的。在模拟MTA诱导DPSC分化的过程中，MTA增加了P42MAPK、P44 MAPK和P38MAPK以及JNK1/2的磷酸化水平；而抑制P42MAPK和P44MAPK，则削弱了MTA对成牙本质细胞分化的作用。这些结果为牙本质再生与修复提供了一个新的思路，可以通过调控MAPK信号转导通路进行细胞功能的调控。近年来，Biodentine这种新型的三钙硅酸材料的诞生，弥补了MTA操作性能不佳、凝固时间长和变色等不足之处。Biodentine作为一种具有生物活性的材料，同样可促进DPSC分化，而且是通过MAPK信号转导通路、钙调蛋白激酶2信号转导通路发挥作用的［13］。这些研究结果表明，MTA和Biodentine都可通过MAPK信号转导通路促进DPSC分化为成牙本质细胞，如果未来能更深刻地理解和阐明其中的信号转导机制，将能极大地促进口腔材料学的发展［14］。

Zhang等［15］发现不仅在药物材料中，而且在组织工程支架诱导DPSC分化的过程中也有MAPK信号转导通路的参与。他们在用五种不同的组织工程支架诱导DPSC向成牙本质细胞分化时发现，在五种支架上都出现了不同水平的ERK1/2信号转导通路和P38MAPK信号转导通路磷酸化活动的增强，但却未见JNK信号转导通路磷酸化活动增强。当抑制ERK1/2和P38MAPK这两条信号转导通路时，明显导致其碱性磷酸酶活性降低和牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，DSPP）、牙本质基质蛋白-1的mRNA低水平表达；而JNK信号转导通路被抑制时，上述成牙本质细胞分化标志物的水平却没有相应的变化。这就表明，ERK1/ 2和P38MAPK信号转导通路参与调控了DPSC的分化，支架材料通过激活ERK1/2和P38MAPK信号转导通路来促进DPSC的分化。

3　MAPK在牙髓损伤修复中的作用

当牙发育完成后，牙髓通过自我平衡和自我保护机制来支持牙本质的生长，同时牙髓可重新启动牙本质的形成来进行自我保护。早期的研究显示，当牙髓受到严重损伤时，牙髓细胞会从牙髓的中央区迁移至牙髓的边缘区并分化为类成牙本质细胞，取代死去的成牙本质细胞产生修复性牙本质［5，16-17］；因此，牙髓-牙本质再生包括DPSC迁移并黏附至损伤处，进一步分化为类牙本质细胞，形成第三期牙本质［18］。

3.1MAPK参与牙髓损伤修复中DPSC的迁移和黏附

龋病致病菌会造成牙体的损害，但是这些致病菌同样对于牙髓-牙本质再生起着重要的作用。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）一种是存在于革兰阴性菌细胞壁的主要致病因子［19］，且与牙髓炎有关［20］。适宜质量浓度（1 mg·L-1）的LPS可以通过上调黏附因子和趋化因子的表达，激活核因子（nuclear factor，NF）-κB、ERK、JNK和P38-MAPK信号转导通路促进DPSC的迁移和附着［21］。

3.2MAPK参与牙髓损伤修复中DPSC的分化

He等［22］发现在LPS诱导DPSC分化的过程中，当抑制Toll样受体4、ERK和P38MAPK信号分子时，DPSC的分化活动被抑制；当抑制JNK和NF-κB信号分子时，DPSC的分化活动却不受影响。该结果表明，LPS可以通过Toll样受体4、ERK和P38MAPK信号转导通路，而不能通过JNK和NF-κB信号转导通路调控DPSC的分化。

3.3MAPK参与牙髓损伤修复中牙本质的形成

Simon等［23］通过一系列的研究发现：在初期牙本质形成时，P38基因在成牙本质细胞中高表达；在第二期牙本质形成时，细胞进入静默状态，P38基因表达下调；在第三期反应性牙本质形成时，P38基因表达上调且其磷酸化和核转位增强。这就证明在初期牙本质和第三期反应性牙本质形成阶段，P38MAPK信号转导通路均被激活。

MAPK信号转导通路还通过间接方式参与牙髓损伤修复中牙本质的形成。研究［24-25］显示，龋源性牙髓炎经常伴随着牙髓中微小血管的形成，但其微小血管在牙本质形成阶段同样具有重要的作用，其中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是微小血管形成的重要因素。LPS可通过MAPK信号转导通路在DPSC中产生VEGF，这就为控制牙髓炎中的血管反应提供了治疗靶点，小剂量的MAPK信号抑制剂产生的瞬间抑制作用也为后期修复性牙本质的形成提供了可能［26］。

3.4MAPK在牙髓损伤修复中的调控机制

经过研究，MAPK信号转导通路在牙髓损伤修复中的作用已经明确，但其在DPSC损伤发生时启动增殖和分化的具体机制仍不清楚。Téclès等［5］认为：干细胞沉默与激活间的平衡是组织保持稳态、刺激生长和启动修复等活动的重要因素，人DPSC也具有完全相似的特点；牙发育完成后，人DPSC一直处于细胞周期中的静止期，直到牙髓遭到严重损伤时才会重新进入细胞周期，向成牙本质细胞分化，从而产生修复性牙本质。Vandomme等［27］在研究中发现：P38MAPK信号转导通路和胰岛素样生长因子1受体（insulin-like growth factor-1 receptor，IGF-1R）信号转导通路对于保持DPSC的静默状态有重要的作用，当二者被抑制时候可以调控DPSC向成牙本质细胞分化；同时，P38-MAPK信号转导通路和IGF-1R信号转导通路之间存在着串话现象，然而信号转导子和转录激活子（signal transduction and activator of transcription，STAT）3是这两条信号转导通路汇聚的关键点。他们结合其他学者［28-29］的研究成果，构建了一个P38MAPK信号转导通路和IGF-1R信号转导通路共同协作，影响DPSC自我更新和分化进程的工作模型。根据该模型可推测，当牙髓细胞未受到严重损伤时，具有显性效应的P38MAPK信号分子可以使STAT3和糖原合成酶激酶3失活，从而让DPSC保持在静止期，仅进行自我更新，不进行分化。P38MAPK的这种显性效应是因为其存在于大部分DPSC核内，核定位决定了该激酶的激活形式［30-31］；因此，P38MAPK在DPSC中是持续激活的，从而保证了DPSC一直处于静默状态，而IGF-1R对保持细胞静默状态也起着一定的作用［19，32］。

当牙髓细胞受到严重损伤时，P38MAPK信号转导通路和IGF-1R信号转导通路被抑制，激活DPSC并使其退出细胞周期中的G0期，从而进行增殖或分化；但是二者对STAT3却有着截然不同的作用效果，P38MAPK信号转导通路被抑制，导致STAT3磷酸化水平增加，细胞外基质磷酸糖蛋白（matrix extracellular phosphoglycoprotein，MEPE）表达下降；IGF-1R信号转导通路的抑制，导致STAT3磷酸化水平下降，MEPE表达上升。当成牙本质细胞进行分化时，MEPE表达上升，说明STAT3磷酸化水平下降，此时P38MAPK信号转导通路又重新被激活，IGF-1R信号转导通路持续抑制。

综上所述，IGF-1R和P38MAPK这两条信号转导通路对保持DPSC的静默状态起着重要的作用，当抑制这两条通路时可以激活DPSC进行自我更新；通过抑制STAT3磷酸化，又可以重新激活P38MAPK信号转导通路，促进DPSC进行分化。这些研究阐释了感染和损伤牙体中修复性牙本质的形成机制，为今后的口腔再生医学研究提供了有力的依据。

4　小结

目前，有关MAPK信号转导通路对DPSC分化调控的研究，主要集中在对DPSC的信号诱导机制及信号转导机制方面。在外源性诱导环境下，MAPK信号作用增强，对诱导信号的反应性增加的转导细胞，可以使DPSC向成牙本质细胞分化；同时，MAPK信号转导通路还可以通过触发侧向抑制，使具有多向分化能力的DPSC受到抑制，保持未分化状态。此外，MAPK信号转导通路还与其他细胞因子共同发挥调节作用，对于这种协同作用的深入研究，有助于体外培养条件的优化及揭示DPSC定向分化的机制，从而发挥DPSC强大的组织工程用途。

由于信号转导在细胞的增殖、分化和生存等过程中都起着十分关键的作用，因而逐渐成为解决诸多重要理论及实践问题的基本思路和有力武器；当然，有待深入研究的问题还有很多，例如对于MAPK信号转导通路的反应分子、作用底物、作用机制及调控机制仍然有待进一步深入的研究。

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（本文采编王晴）

Regulation of mitogen-activated protein kinase in the odontoblast differentiation of dental pulp stem cells and pulp injury and reparation

Lin Ying1，Qin Wei1，Zou Rui2，Lin Zhengmei1.（1.Dept.of Conservative Dentistry and Endodontics，Guanghua School of Stomatology，Hospital of Stomatology，Sun Yat-sen University，Guangdong Provincial Key Laboratory of Stomatology，Guangzhou 510055，China；2.Institute of Oral Diseases Research，Key Laboratory of Stomatology，The Affiliated Stomatological Hospital，Guangzhou Medical University，Guangzhou 510140，China）

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China（81271124）.

［Abstract］Several more alternatives can be offered for the treatment of carious pulp disease and restoration of lost teeth by inducing the odontoblast differentiation of dental pulp stem cell（DPSC）.Mitogen-activated protein kinases（MAPK），specifically P38MAPK，are involved in various cellular functions，such as cell proliferation，differentiation，and apoptosis，by transducing extracellular signal to the cell and nucleus through transcription factor phosphorylation.In addition，bone morphogenetic protein-2，mineral trioxide aggregate，and biodentin can induce the odontoblast differentiation of DPSC by regulating MAPK signaling pathway and certain scaffolds in tissue engineering.Moreover，the MAPK signaling pathway performs an important function in the migration，adhesion，and differentiation of DPSC during dental pulp injury.Based on the key function of MAPK signaling pathway，further study on the molecule，substrate，and mechanisms is crucial.

［Key words］mitogen-activated protein kinase；dental pulp stem cell；signal transduction pathway；differentiation

［收稿日期］2015-06-25；［修回日期］2015-12-15

［基金项目］国家自然科学基金（81271124）

［作者简介］林颖，硕士，Email：liny27@mail2.sysu.edu.cn

［通信作者］林正梅，教授，博士，Email：linzhm@mail.sysu.edu.cn

［中图分类号］Q 55

［文献标志码］A［doi］ 10.7518/gjkq.2016.03.020