干细胞和支架与牙髓再生及其血运重建

李州许庆安，2.口腔基础医学省部共建国家重点实验室培育基地和口腔生物医学教育部重点实验室，武汉大学口腔医学院；2.武汉大学口腔医院牙体牙髓病科 武汉 430079



干细胞和支架与牙髓再生及其血运重建

李州1许庆安1，2
1.口腔基础医学省部共建国家重点实验室培育基地和口腔生物医学教育部重点实验室，武汉大学口腔医学院；2.武汉大学口腔医院牙体牙髓病科 武汉 430079

［摘要］在牙髓再生中，获取干细胞的方法包括干细胞移植、细胞归巢和诱导出血。干细胞移植可产生异位的牙髓样组织，可控制移植细胞的数量并选择对牙髓再生潜在效能最佳的细胞亚种。细胞归巢是指利用信号分子招募宿主内源性干细胞至需治疗的牙体根管中增殖和分化，形成牙髓-牙本质样组织。诱导根尖出血进入根管为年轻恒牙牙髓再生的一个重要步骤。支架是细胞在合成组织时的支撑结构，可促进细胞黏附，为牙髓再生提供有利的环境。牙髓再生离不开血运重建或者血管再生，感染控制、根管预处理、冠方封闭等操作，可为牙髓再生包括其血运重建提供适宜的环境。总之，组织工程技术在牙髓领域的应用发展为牙髓再生带来了新的希望。

［关键词］牙髓再生；组织工程；干细胞；支架；细胞因子

牙髓被无让性的牙本质包围，其血液供给缺乏有效的侧支循环，因此牙髓一旦发生病变一般难以自身修复。此时通常会选择去除牙髓、保留患牙为目的的治疗方法，譬如根管治疗。目前根管治疗技术已臻成熟，成功率也较高，但根管治疗后的牙体存在低血运和低感觉，易折，牙根不再发育等缺点，牙髓再生或许是解决这一问题的办法之一。牙髓再生被定义为更换包括牙本质、牙根结构和牙髓-牙本质复合体细胞这些受损结构的基于生物学的过程［1］。就概念而言，再生包括牙髓血运以及神经及其分布在牙本质表面的成牙本质细胞层等。与干细胞、支架和生长因子组织工程三大要素相类似，在牙髓再生中，干细胞、支架和生长因子以及适宜的环境都是不可或缺的重要要素。

1　干细胞与牙髓再生

据悉［2-3］至少有5种间质干细胞可分化为牙髓干细胞（dental pulp stem cell，DPSC）、脱落乳牙牙髓干细胞、牙乳头干细胞、牙囊干细胞、骨髓基质干细胞等成牙本质样细胞，牙髓再生中优先选择DPSC［4］。目前，牙髓再生中利用干细胞的方式包括干细胞移植、细胞归巢和诱导出血等。

1.1干细胞移植

细胞重现和组织工程技术在人体其他系统中发展较快，但其还没有很好地应用到再生性牙髓治疗当中。研究［5-9］证明，牙髓或其他干细胞移植可产生异位的牙髓样组织，而且可以控制移植细胞的数量并选择对牙髓再生潜在效能最佳的细胞亚种。

在临床上，在一个需要做牙髓再生的患者口中获取DPSC较难操作。当感染局限时，保留部分健康活髓或许可以提供内源性干细胞，但这依赖于对牙髓状态的准确判断，且活髓切断术在恒牙的成功率较乳牙要低。对于死髓牙，则需考虑从根尖区或血液中获取干细胞，而且干细胞的数量和潜能随着人年龄的增长而下降。理论上可以从第三磨牙中提取DPSC，经试验室培养处理后移植到需治疗的牙体中。Alongi等［10］认为，炎症会刺激干细胞的补充和分化，可以从感染的牙髓组织中提取干细胞，但仍有风险。其他的干细胞能否再生牙髓组织目前还缺乏确切的报道。异种和同种异体细胞移植都有免疫排斥的风险。细胞低温贮藏有潜在的细胞损失和额外费用。细胞移植的花费和技术要求以及污染和细胞变异等风险，对于牙髓治疗来说似乎较难接受。通过细胞移植进行牙髓再生还需要技术、管理及商业化上的发展作为支持，否则干细胞移植就只能停留在科学试验阶段而难以应用于临床实践［11］。

1.2细胞归巢

细胞归巢是细胞移植的替代选择之一。细胞归巢最初是指造血干细胞从骨髓迁移到外周形成干细胞龛，可扩展为宿主内源性细胞的补充及随后的组织［12］。牙髓再生中的细胞归巢是指利用信号分子的诱导作用，招募宿主内源性干细胞至需治疗的牙体根管中增殖和分化，形成牙髓-牙本质样组织。信号分子被认为是激活再生过程的生物线索，包括生长因子、细胞因子以及一些化合物或激素等。Kim等［13］曾运用细胞归巢的方法在仿上颌第一磨牙支架中实现了牙样结构的再生。

用于牙髓再生的生长因子有碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、血小板衍生生长因子（plateletderived growth factor，PDGF）、神经生长因子（nerve growth factor，NGF）、骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）7、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）、转化生长因子（transforming growth factor，TGF）β1和胰岛素样生长因子等［14-15］。bFGF、VEGF、PDGF和FGF2均有促进血管新生的作用，bFGF、VEGF和FGF2还能促进细胞趋化，VEGF促进有细胞丝分裂，NGF有利于神经细胞的存活和生长，BMP7促进组织矿化。Kim等［16］将含生长因子的胶原蛋白支架置于预备后的根管中，再将其植入鼠背皮下3～6周发现，有血管、成牙本质样和神经样成分牙髓样组织充满根管全长。Torabinejad等［17］在再植的年轻前磨牙中注入富血小板血浆（plateletrich plasma，PRP），利用其所含的多种信号分子及其支架作用引导干细胞归巢，从而实现牙髓再生，效果良好。

细胞归巢避免了细胞移植所需要的细胞处理步骤，充分利用了患者自身干细胞，这在一定程度上减小了操作的难度和风险［18］。

1.3诱导出血

对于未发育成熟的死髓牙，诱发出血这一步可使大量未分化的间质干细胞涌入根管，而且引入血液中干细胞的数量明显较系统血液要高［19］。此方法长入根管内的新生组织是牙周膜样、牙骨质样或者骨样的组织，这可能与干细胞来源于残留活髓和根尖乳头有关［20］。对于发育成熟的恒牙，诱导根尖出血理论上也可引入干细胞，具体效果仍需进一步研究证实。也有学者［21］认为，仅诱导出血不足以引导干细胞增殖分化成牙髓-牙本质复合体，还应辅以生长因子。Galler等［22］认为，此种通过损伤来刺激机体自身愈合机制的方式，可募集已存在于患者体内的细胞群落，解锁机体与生俱来的再生能力。其可行性为最近的概念验证研究所证明，前景广阔［23］。与基于细胞的方法相对应，将这种方法称为不依赖于细胞的方法。

近年来，临床上运用该方法实现牙髓再生的病例多有报道［24-26］，且以年轻恒牙居多。部分病例中患牙牙根生长、根尖孔封闭和根管壁增厚且牙髓活力与对照牙相似。成熟恒牙相关的成功病例寥寥可数。Paryani等［27］报道了两例牙根已发育完全的恒切牙的牙髓再生，根尖暗影减小直至消失，临床症状消失，其中一例牙髓测试有反应。Saoud等［28］也报道了一例带大面积根尖暗影的成熟死髓牙的牙髓再生，牙髓再生良好，除了牙髓测试无反应。这些病例给成熟恒牙的牙髓再生带来了希望，但仍有待远期临床观察和进一步的大样本研究。

2　支架

支架是细胞在合成组织时的支撑结构，可以促进细胞黏附，为牙髓再生提供有利的环境［29］。在组织再生中，细胞的活力及其增殖和分化，会受到支架的空隙大小、互联性和降解率的影响［30］。

在牙髓再生研究中，常用的支架材料有天然聚合物、透明质酸、脱乙酰壳多糖（旧称壳聚糖）、聚乳酸（polylactic acid，PLA）等。Zhang等［31］分别用胶原海绵、多孔陶瓷和纤维状钛网作为DPSC培养的三维支架，4周后都有矿化沉积和牙本质涎蛋白表达；将其移植到小鼠皮下6～12周，均有牙本质涎磷蛋白表达；但所形成的组织更类似结缔组织而非牙本质样组织，而且只有陶瓷支架组有少量的细胞外基质矿化物形成。李红玖等［32］用牙髓中的DPSC和TGFB，以可吸收明胶海绵为支架加三氧化物聚合体（mineral trioxide aggregate，MTA）诱导冠髓再生。PLA、聚左旋乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物和聚己内酯这些合成聚合物无毒、可生物降解，其理化性质（如机械强度、降解速率、孔隙率和微观结构）能精确控制，可用作牙髓再生的支架材料。

有研究用纳米纤维作重建牙髓-牙本质复合体的支架发现，纳米纤维可促进细胞黏附、增殖和成牙本质向分化。有学者认为，自组装多肽水凝胶利用天然氨基酸模拟细胞外基质，生物相容性和降解性能俱佳，其纳米纤维状结构利于细胞间相互作用，且含肝素的结构可结合保护并缓慢释放生长因子（例如TGFB1、FGF2、VEGF等），这些在牙髓再生的临床应用中都是至关重要的。对于根管这种狭窄的空间，可注射性支架或许更为适用。

近年来PRP、富血小板纤维蛋白和血凝块也在牙髓再生中充当着支架角色。有研究在探讨不同浓度的PRP支架在小型猪体内趋化内源性干细胞、诱导牙髓组织再生的能力时发现，合适质量分数的PRP（例如50%PRP）释放的生长因子可发挥最佳的效应，有利于干细胞归巢并促进血管生成，其作为生物支架在体内再生牙髓样的组织是可行的，但需要对其理化性质进行进一步修饰；如需从患者血液中提取PRP，技术敏感性和有创性可能限制其推广。有报道称诱导出血中根管内无菌的血凝块含干细胞和生长因子，血凝块自身就可以作为三维支架介导组织再生。

此外，非血管化的支架尺寸通常较小，如果尺寸太大，物质不能充分扩散，可能导致局部营养不足或代谢产物堆积。在体外试验中，为了克服扩散限制，依靠灌注或流式的生物反应器，可促进支架内分子更深层的交换。也有研究利用光蚀刻等精密加工技术制造组织工程支架，形成利于物质交通的微通道和血管网。

3　牙髓再生的血运重建

在牙髓学文献［4］中，牙髓血运重建通常定义为根管系统内血管的再引入。近年关于牙髓血运重建的报道［24］较多，但大部分对象是年轻恒牙。有学者认为，血管重建和传统根尖诱导及根尖屏障的区别在于同时有根管长度和管壁厚度的增加。牙髓再生离不开血运重建或者血管再生。无论是扩大根尖孔、利用脱位回植牙和坏死牙自身血流，还是促进其局部的血管再生，都值得研究；但若没有疼痛反应或者神经纤维、成牙本质细胞层、间质成纤维细胞以及干细胞，或许都不能被认为是完整的牙髓再生［11］。过度严格地区分，可能限制了新药品、新设备、新治疗方法的发展和研究，现在不去过度讨论牙髓再生和牙髓血运重建的区别可能对其发展更为有利。在临床中，感染控制、根管预处理、冠方封闭等操作，可为牙髓再生包括其血运重建提供适宜的环境。

3.1感染控制

牙髓治疗的核心是控制感染，再生性治疗更是如此。次氯酸钠具有溶解坏死组织和涂层中有机成分，抑制或杀灭生物膜和牙本质小管中的病原微生物的作用。乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）能螯合金属离子和钙离子，既能去除根管涂层，又能切断细菌的营养而抑制细菌生长。临床上二者常联合应用。牙髓再生研究中常使用质量浓度较高的根管冲洗剂。另有学者［24，32］提倡在髓腔、根管中封抗生素。也有研究认为使用三联抗生素易致牙冠变色、细菌耐药或机体变态反应。

3.2根管预处理

根管冲洗等操作除了有消毒灭菌的作用外，还可能影响细胞的行为。有学者报道，经次氯酸钠和EDTA处理过的牙本质壁有利于细胞的黏附。有学者发现，用5.25%次氯酸钠灌洗后的牙本质表面会促进移植的干细胞分化成有吸收表层牙本质功能的多核细胞；单独或在次氯酸钠后使用质量分数17%的EDTA，干细胞可分化为成牙本质样细胞并有牙本质涎蛋白表达。他们认为，EDTA使牙本质表面脱矿，暴露并释放生长因子；冲洗液的选择和使用的次序等可能影响牙本质的表面性能，从而影响细胞分化。

3.3冠方封闭

长期的冠部渗漏是牙髓治疗失败的主要原因之一。MTA可以有效减少冠方渗漏，为牙髓再生提供一个无菌的环境。总之，DPSC移植从试验室研究应用到临床还有很多问题亟待解决。在细胞归巢中，支架和信号分子的掌控有待进一步研究。将牙髓再生各要素最优化，融为牙髓-牙本质复合体仍面临极大的挑战。就目前的牙髓再生来说，不依赖于细胞的方法较之组织工程技术，从生物安全性、可实践性、费用等方面考虑，可能更为适合；但是，现在仍缺乏随机对照试验或大样本病例分析及长期的随访资料，治疗成功的标准也还没有统一的明确的界定，这些都限制着牙髓再生技术的应用；而且，临床上的牙髓再生较多关注的是未发育成熟的牙体，如何扩大适应证、向成熟恒牙拓展成为一个普遍可行的临床治疗策略，仍需不断地研究探索。

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（本文采编王晴）

Stem cells and scaffolds in dental pulp regeneration and revascularization

Li Zhou，Xu Qing’an.（1.The State Key Laboratory Breeding Base of Basic Science of Stomatology （Hubei-MOST） & Key Laboratory of Oral Biomedicine Ministry of Education，School and Hospital of Stomatology，Wuhan University，Wuhan 430079，China；2.Dept.of Conservative Dentistry and Endodontics，Hospital of Stomatology，Wuhan University，Wuhan 430079，China）

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China（81000435） and the Natural Science Foundation of Hubei Province（2014CFB722）.

［Abstract］Regenerative endodontics is defined as biologically based procedures designed to replace damaged structures，including dentin and root structures，as well as cells of the pulp-dentin complex.The methods of acquiring stem cells include stem-cell transplantation，cell homing，and induced bleeding.Stem-cell transplantation can yield ectopic dental pulp-like tissues，with the advantages of easily controlling the number of cells transplanted and selecting the optimal subpopulation of stem/progenitor cells.Meanwhile，cell homing is defined as the migration of endogenous host stem cells to the root canal of the offending teeth using signaling molecules.The process is also characterized by the subsequent proliferation and differentiation of the endogenous host stem cells into pulp-dentin-like tissues.Inducing pulp bleeding into the root canals of immature permanent teeth is an important step in regenerative endodontics.Scaffold refers to the structural support for the cells that synthesize tissues.This component promotes cell attachment and provides a specific environment conducive to pulp or dentin regeneration.Pulp regeneration cannot take place without revascularization or angiogenesis.Procedures such as infection control，pretreatment of root canals，and coronal sealing，provide a favorable environment for pulp regeneration，including pulp revascularization.The application and development of tissue engineering technology in endodontics bring new hope for dental pulp regeneration，despite the occurrence of numerous problems.

［Key words］dental pulp regeneration；tissue en-gineering；stem cell；scaffold；growth factor

［收稿日期］2015-06-06；［修回日期］2016-02-29

［基金项目］国家自然科学基金（81000435）；湖北省自然科学基金（2014CFB722）

［作者简介］李州，硕士，Email：xlizhou@163.com

［通信作者］许庆安，主任医师，博士，Email：xuqingan@whu.edu.cn

［中图分类号］Q 81

［文献标志码］A［doi］ 10.7518/gjkq.2016.03.011