动物温度依赖型性别决定中的表观遗传学机制

滑留帅，茹文秀，白献晓，龚世平

（1.广东省生物资源应用研究所，广东 广州 510260；

2.河南省农业科学院畜牧兽医研究所；

3.西北农林科技大学动物科技学院）

专论综述

动物温度依赖型性别决定中的表观遗传学机制

滑留帅1，2，茹文秀1，3，白献晓2，龚世平1*

（1.广东省生物资源应用研究所，广东 广州 510260；

2.河南省农业科学院畜牧兽医研究所；

3.西北农林科技大学动物科技学院）

性别决定是生物学的一个核心问题，其中动物的温度依赖型性别决定（TSD）是一个复杂而有趣的生物学现象。激素和性别决定相关基因在动物TSD中的调控作用已经有较为全面的研究，但是激素水平和性别决定相关基因如何响应环境温度的变化仍不明确。最近的表观遗传学研究表明，环境温度通过表观遗传修饰的方式改变性别决定相关基因的表达变化，可能是动物TSD的重要调控方式。例如，芳香化酶是合成雌激素的限速酶，而温度诱导的芳香化酶基因启动子区甲基化是黑鲷鱼和红耳龟等TSD动物性别决定的关键；除甲基化修饰外，ncRNAs和组蛋白修饰均被证明参与了GSD动物的性别决定过程，但是对于TSD动物来讲，环境温度如何影响机体的ncRNAs和组蛋白修饰水平仍缺乏足够的研究。进一步探讨TSD中的表观遗传学机制，对于理解动物的性别决定生物学过程具有重要的意义。

温度依赖型性别决定；表观遗传修饰；甲基化；ncRNAs；组蛋白修饰

性别决定是生物学的一个核心问题，性别决定过程不仅能够影响个体的发育方向，而且能够影响种群的结构、动态和命运［1］。动物的性别决定是由遗传因子和外界环境共同决定的，基本上可以分为两种类型：遗传型性别决定（GSD）和环境型性别决定（ESD）。其中GSD类型的动物在受精时就已决定了个体的初始性别，主要包含的类型有：①XX/XY型，如哺乳动物，具有XX同型染色体为雌性，具有XY异型染色体为雄性；②ZZ/ZW型，如鸟类，具有ZZ同型染色体为雄性，具有ZW异型染色体为雌性。ESD类型动物的性别则由其受精后胚胎所处的环境条件决定，包括：温度、pH值、盐分含量等，甚至群体性比、病原体等。在脊椎动物中ESD的一种主要表现形式为温度依赖型性别决定（TSD），即个体性别依赖于胚胎发育过程中的环境温度，TSD在鱼类和爬行类动物中最为常见。

1 动物TSD调控机制的研究现状

1.1 TSD的分类

动物的TSD基本上可以分为三种类型［2］：①TSD Ia（MF）型：即低温产雄性，高温产雌性。TSD Ia是动物TSD的主要类型，例如常见的乌龟、红耳龟、锦龟等都属于此类别；②TSD Ib（FM）型：即低温产雌性，高温产雄性。TSD Ib在部分蜥蜴、多种鱼类中有过报道；③TSD II（FMF）型：即低温和高温均产雌性，中间温度产雄性。在龟鳖类、蜥蜴类和鳄类中都存在有TSD II模式。

1.2 激素在TSD中的调控机制

动物的性别决定包括两个方面：一是性腺的决定和发育，称为初级性别决定，主要包括原始性别的决定、性腺的发育；二是附属性器官、特征及性行为的建立称为次级性别决定，主要包括在动物体内睾丸或卵巢形成后，由各自的性腺或者生殖腺分泌性激素来促使相关组织、附属组织和器官的发育以及性行为的形成和建立。对于TSD动物来讲，激素在初级性别决定和次级性别决定过程中都起了关键的作用，在产生雄性的孵化温度下，睾酮（T）由5α-还原酶作用转化为双氢睾酮（DHT），然后经过级联反应最终诱导胚胎发育成雄性幼体；在产生雌性的孵化温度下，睾酮由芳香化酶作用转化为雌二醇（E2），然后经过一系列反应最终诱导胚胎发育成雌性幼体。在卵孵化过程中，使用外源雌激素处理，可以诱导处于雄性孵化温度中的胚胎发育成雌性。但是，使用外源雄激素处理却不能诱导雌性孵化温度中的胚胎发育成雄性。可能因为睾酮被芳香化酶催化后转换成了雌激素；如果利用芳香化酶抑制剂抑制其作用，则可在雌性温度条件下产生雄性胚胎。激素在TSD中的调控作用已经基本明确，但是激素水平响应环境温度的具体分子机制仍不确定。

1.3 性别决定相关基因与TSD

早期研究认为动物的TSD和GSD为2种独立的性别决定系统，新的研究表明两者并非完全独立，而是具有一定的关联性。比较基因组分析表明，许多在GSD动物中调控性腺分化的基因在TSD动物中都是保守的，且进一步的功能验证表明，它们在TSD动物的性别决定中大多还拥有类似的调控功能，提示TSD和GSD在分子水平可能采用了相同的调控通路。目前已经验证的性别决定相关基因包括：Sox9、Sf-1、Dmrt1、Wt1、Wt4、Dax1、FoxL2、Cyp19a1、Mis等［3］。这些基因在GSD和TSD动物中都是性别决定的关键调控因子，但对于TSD动物来讲，比较特别的地方在于，环境变化对部分性别决定基因的表达水平具有决定性的作用，从而能够决定胚胎的性别。与激素调控TSD的研究类似，这些性别决定相关基因在TSD动物中如何响应环境温度变化仍不明确。

2 表观遗传修饰在TSD中的调控机制

表观遗传是指DNA序列不发生变化，但基因表达却发生了可遗传的改变。表观遗传修饰很大程度上介导了机体对环境变化的响应，同时也整合了环境与基因组信息来产生特定的表型。近期的研究表明，环境温度通过表观遗传修饰的方式改变性别决定相关基因的表达变化，可能是TSD的重要调控方式。表观遗传修饰主要包括三种方式：DNA甲基化、非编码RNA和组蛋白修饰调控。通常情况下，表观遗传修饰都不是单独发生的，这三种机制往往存在交互作用，共同调控目的基因的表达，进而参与了植物、无脊椎动物或脊椎动物的性别决定和性腺分化。

2.1 DNA甲基化在TSD中的调控作用

DNA甲基化往往发生在基因的启动子区或调控区域，DNA甲基化能够通过抑制基因的转录来调节基因的功能。环境变化可能通过改变ESD动物性别决定相关基因的甲基化修饰模式来决定后代的性别。近期我国的学者对半滑舌鳎的全基因组进行了测序，并分析了全基因组的甲基化修饰与性别决定的关系。半滑舌鳎属于ZZ/ZW性别决定类型，正常雌鱼在温度控制之下能够发生性逆转而变为伪雄鱼。性逆转后伪雄鱼全基因组的DNA甲基化模式变得跟正常雄鱼几乎一模一样，而且，DNA的甲基化主要富集在与性别决定通路有关的基因上。半滑舌鳎的证据进一步从基因组水平证明了甲基化修饰在性别决定调控中的重要性。在非哺乳类的脊椎动物中，芳香化酶（Cyp19a1）是将雄激素转化为雌激素的关键酶，从而参与调控雌性的卵巢发生。在许多鱼类和爬行动物中，温度诱导的雄性化都与Cyp19a1的表达抑制相关联，而最近的研究表明Cyp19a1基因启动子区的甲基化可能是连接温度变化和性别决定的桥梁。例如欧洲鲈鱼的性别是由环境和遗传共同调控的，其性别决定的温度敏感期（TSP）位于幼体期，温度诱导的雄性化被证明与Cyp19a1基因启动子区的甲基化水平上升相关联，但是温度变化伴随的Cyp19a1基因启动子区的甲基化只能在性腺中检测到，而在大脑中检测不到，说明该甲基化对温度的响应还具有组织特异性。温度诱导的Cyp19a1基因启动子区甲基化模式还存在一定的物种间保守性，例如在黑鲷鱼和红耳龟的性别决定过程中，Cyp19a1基因启动子区甲基化修饰也起到关键的调控作用。相对于Cyp19a1基因，Sry基因是哺乳动物睾丸发育的关键调控基因，小鼠上的研究表明DNA甲基化对Sry的时空表达具有重要的调控作用。乌龟是典型的TSD Ia型爬行动物，乌龟的Sox9基因（爬行动物的Sry同源基因）在雄性孵化温度下存在显著高表达［4］，但是爬行动物Sox9基因的表达是否接受DNA甲基化调控需要进一步的试验验证。对其余TSD动物来讲，笔者推测甲基化修饰可能是其温度依赖型性别决定的重要调控机制之一，通过改变启动子区的甲基化修饰水平，性别决定基因能够响应孵化温度的变化，改变其表达水平，进而决定了性腺的发育方向，但这样的推测需要进一步的试验验证。

2.2 ncRNAs在TSD中的调控作用

除了甲基化修饰外，ncRNAs也是动物性别决定的重要调控方式。ncRNAs是指不翻译为蛋白质的有功能的RNA分子，被认为是表观遗传修饰的重要组成方式。参与表观遗传调控的ncRNAs主要有两类：长非编码RNAs（lncRNAs；＞200 nt）和小RNAs（miRNAs；19-25 nt）。ncRNAs通过招募表观遗传沉默复合体进而结合在基因组或转录组的同源位点来实现对目标基因的表达调控。ncRNAs在植物、昆虫、鱼类、鸟类、哺乳动物中均被证明参与了性别决定的过程。例如在大西洋大比目鱼中多个miRNAs的表达水平存在性别差异，且当使用芳香化酶抑制剂诱导动物雄性化后，部分miRNAs的表达水平也相应地发生了改变，提示部分miRNA参与了激素调控的信号通路。在鸡的性别决定过程中，miR-202*在雄性中高表达，从而推测其与鸡的睾丸发育相关。给发育至4.5 d的雄性胚胎（ZZ）注射雌激素（E2）诱导其雌性化时，能够观测到miR-202*的表达显著降低，同时还能观测到睾丸生成调控基因Dmrt1和Sox9的表达下调，而卵巢生成调控基因FoxL2和Cyp19a1的表达则显著上调。相反的，用芳香化酶抑制剂处理3.5 d的雌性胚胎（ZW）时，能够观测到miR-202*的表达显著上调，同时伴随的还有Dmrt1和Sox9的上调以及FoxL2和Cyp19a1的下调。虽然目前已经证明ncRNAs参与了动物的性别决定过程，并已经鉴定了许多雌雄间差异表达的ncRNAs，但是这些结果多是在GSD动物中被发现。关于TSD动物中的ncRNAs的研究尚未见报道，有哪些ncRNAs尤其是miRNAs参与了TSD的调控过程，这些ncRNAs的表达如何响应孵化温度的变化，以及这些ncRNAs如何与已知的性别决定基因互作都是未知的，阐明这些问题有助于进一步深入理解动物TSD的分子调控机制。

2.3 组蛋白修饰在TSD中的作用机制

核小体是染色质的基本组成单位，由一个组蛋白八聚体（由4种组蛋白H2A、H2B、H3和H4组成，每一种组蛋白各二个分子）、一个H1组蛋白和一段DNA构成。组蛋白修饰在转录水平对基因表达存在调控作用，例如，H3K9me（组蛋白H3第9位赖氨酸甲基化）是H3的重要修饰方式，其能够参与异染色质的形成和转录沉默过程。许多参与组蛋白修饰的酶对于外界环境变化都很敏感，因此能够介导环境变化对基因表达的影响。缺乏H3K9去甲基化酶的XY小鼠，常常表现出性逆转特征或彻底发育为不育的雌性小鼠。基因表达分析表明，H3K9去甲基化酶的缺失显著下调了胚胎发育期Sry基因的表达水平。而在野生型的XY小鼠中，体细胞的Sry位点有大量的H3K9去甲基化酶聚集，进而导致H3K9me2的升高和H3K4me3的降低。这些证据均证明组蛋白修饰在动物性别决定中可能有的重要作用。PcG蛋白是一组通过染色质修饰调控靶基因的转录抑制子，在小鼠上的同源基因为CBX2，CBX2突变型小鼠有一半会在断奶前死掉，而剩余的则表现出性腺发育不全和雄性到雌性的性逆转。性腺生长缺陷出现的时间与Sry表达的时间相一致，说明CBX2缺陷引起的性逆转可能与Sry的表达有关。进一步通过蛋白质组和免疫组化分析表明，一系列的转录因子，包括Sry、Sox9、Lhx9、Ad4BP/SF-1、Dax-1、Gata4、Arx和Dmrt1的表达均受到CBX2基因敲除的影响。在CBX2基因敲除小鼠中过表达Sry或Sox9基因，能够挽救雄性到雌性的性逆转，这说明CBX2通过Sry基因表达参与了睾丸的发育。对于TSD动物来讲，进一步分析环境温度如何参与组蛋白的修饰过程，或者参与组蛋白修饰的酶的表达量、活性和结合位点如何响应孵化温度的变化，可能是研究组蛋白修饰参与TSD调控的关键。

3 结语

综上所述，动物的温度依赖型性别决定（TSD）是一个复杂而有趣的生物学现象，但其具体的生物学机制仍不明确。表观遗传修饰很大程度上介导了机体对环境变化的响应，环境温度通过表观遗传修饰的方式改变性别决定相关基因的表达变化，可能是动物TSD的一种重要调控方式。进一步分析DNA甲基化、ncRNAs表达和组蛋白修饰如何响应孵化温度的变化；DNA甲基化、ncRNAs和组蛋白修饰之间如何互作；DNA甲基化、ncRNAs和组蛋白修饰如何调控性别决定相关基因和性激素的表达变化，对于理解动物性别决定的生物学过程具有重要的意义。

［1］杜卫国，孙宝珺.爬行动物温度决定性别的现象与机制.生物学通报，2012，47（3）：1-5.

［2］贺斌，史海涛，廖广桥.龟鳖类温度依赖型性别决定机制的研究进展.动物学杂志，2009，44（5）：147-152.

［3］李箫，翁静.哺乳动物性别决定相关基因及其调控机制.生殖医学杂志，2015，24（3）：245-250.

［4］汤文琦.孵化温度对乌龟性别决定基因表达的影响［D］.杭州师范大学，2013.

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1004-5090（2016）09-0011-03

2016-08-16）