GT1-7细胞及其在生殖相关研究中的应用

冯　涛，吴晓敏，许晓玲，白佳桦，宋玉清，肖霖力，韩向敏，刘　彦*（.北京市农林科学院畜牧兽医研究所，北京　00097；.甘肃农业大学动物科学技术学院，兰州　730070）



GT1-7细胞及其在生殖相关研究中的应用

冯涛1，吴晓敏2，许晓玲1，白佳桦1，宋玉清1，肖霖力1，韩向敏2，刘彦1*
（1.北京市农林科学院畜牧兽医研究所，北京100097；2.甘肃农业大学动物科学技术学院，兰州730070）

摘要：GT1-7细胞是GT1细胞株的亚株，通过转基因技术从小鼠下丘脑分离获得的GnRH神经元细胞系，具有高度分化的神经内分泌细胞典型特征。下丘脑GnRH合成和释放对生殖功能具有重要作用，而GnRH神经元在脑内数量少且呈弥散分布，体内研究较困难。目前，GT1-7细胞是研究GnRH神经元的理想离体细胞模型，在生殖相关研究中广泛使用。文章详细阐述GT1-7细胞获得过程、功能特性及其在生殖系统研究中应用，以及影响GT1-7细胞活性的信号通路，以期对动物生殖调控研究提供参考。

关键词：GT1-7细胞；促性腺激素释放激素；生殖调控；信号通路

冯涛,吴晓敏,许晓玲,等. GT1-7细胞及其在生殖相关研究中的应用[J].东北农业大学学报, 2016, 47(1): 102-108.

Feng Tao, Wu Xiaomin, Xu Xiaoling, et al. GT1-7 cells and its application in reproduction-related researches[J]. Journal of Northeast Agricultural University, 2016, 47(1): 102-108. (in Chinese with English abstract)

雌性动物生殖活动受下丘脑-垂体-性腺轴（Hypothalamus-pituitary-gonad，HPG）精密调控，其中下丘脑促性腺激素释放激素（Gonadotropin-re⁃leasing hormone，GnRH）神经元是动物发情周期启动关键部位，GnRH分泌调控是深入揭示动物情期启动关键因素。近年来，分子遗传学得到快速发展，特别是GnRH神经元离体细胞模型—GT1-7细胞的发现，加速生殖内分泌调控领域研究进程。永生GT1-7细胞是从转基因小鼠下丘脑视前区分离到的GnRH神经元细胞，具有高度分化神经内分泌细胞特性，能模拟GnRH神经元功能。GT1-7细胞不但具有原始GnRH神经元多种功能，如节律性脉冲分泌GnRH，多种信号通路调节细胞活性，能表达GnRH、Kiss-1、G蛋白偶联受体54（GPR54）、雌激素受体α（ERα）、雌激素受体β（ERβ）及卵泡抑制素样蛋白等多种生殖相关基因、受体及其蛋白，在动物生殖调控研究中具有重要作用。然而，GnRH神经元作为哺乳动物中枢生殖调控体系最终共同通路，GnRH合成和分泌受诸多因子及神经元相互作用调控，因此利用GT1-7细胞完全模拟GnRH体内调控存在局限性。本文从GT1-7细胞来源和特性及其在生殖相关研究中应用等方面综述，总结影响GT1-7细胞活性信号通路，以期对动物生殖调控研究提供参考。

1 GT1-7细胞来源

GT1-7细胞是GT1细胞株1个亚株。GT1细胞株由美国Mellon等于1990年利用遗传学靶向致肿瘤技术[1]，将致癌猿猴空泡病毒40（Simian vacuolat⁃ing virus，SV40）抗原（Tag）基因及其在GnRH细胞中表达调控基因构建杂合基因后，整合到小鼠受精卵原核中，并将从转基因小鼠子代下丘脑视前区分离得到肿瘤细胞经进一步筛选和克隆，获得同时表达GnRH和Tag基因稳定细胞株。GT1细胞株有3个亚株，分别是GT1-1、GT1-3和GT1-7，均具有高度分化GnRH神经元特征。GT1-7细胞在表型形态、超微结构、基因表达、激素储存以及分泌方式上均与GnRH神经元一致，且能在体外分裂传代，是体外研究GnRH神经元的理想细胞模型[2]。

2 GT1-7细胞特性

GnRH神经元是哺乳动物中枢生殖调控体系最终共同通路，仅分布于前脑嗅区、隔区及下丘脑等区域。下丘脑是由许多功能各异神经核团组成结构复杂器官，体内精确研究GnRH神经元及相关功能难度较大，通过原代培养方法直接研究下丘脑GnRH神经元功能也存在很大困难。因此，目前研究多利用下丘脑永生GnRH神经元细胞系GT1-7细胞开展相关研究。

2.1 GT1-7细胞分泌模式

GT1-7细胞表现GnRH神经元形态，且保留许多原始GnRH神经元功能[3-4]。Martinez等研究发现，GT1-7细胞在体外表现出与GnRH神经元类似脉冲分泌模式，下丘脑GnRH神经元分泌GnRH平均脉冲间隔25.8 min，平均持续时间18.8 min[5]。GT1-7细胞分泌GnRH平均脉冲间隔24.8~45.4 min，平均脉冲幅度14.30~191.5 pg·min·mL-1，平均脉冲持续时间为21.30 min[4-8]。可见GT1-7细胞与GnRH神经元细胞脉冲情况基本一致，细微差异可能与培养液种类、细胞系传代次数以及培养时间等条件有关。

2.2时钟基因对GT1-7细胞分泌调节

GnRH神经元细胞含有分子时钟，昼夜信号可有效分配到多个组织[9]。研究表明，GT1-7细胞能表达多种时钟基因，包括Bmal1、Clock、mCry1、mCry2、mPer1、mPer2、mPer3和CKIε，这些基因也在下丘脑视交叉上核（SCN）和外周细胞中表达[10]。在GT1-7细胞中用显性失活Clock-Δ19基因瞬时表达能扰乱生物钟功能进而破坏GnRH正常昼夜分泌模式，显著降低平均脉冲频率；过表达负调控Limb基因mCry1可显著增加GnRH脉冲幅度，而对脉冲频率无显著变化[11]。Eileen等将GT1-7细胞暴露于0.1 U·mL-1凝血酶（诱导Ca2+内流）也可显著增加脉冲振幅，但对持续时间影响不显著，推测可能与GT1-7细胞特定膜结合受体及细胞膜上时钟基因有关[7]。Blackman等研究表明，GT1-7细胞内cAMP水平通过环核苷酸门控通道（CNGs）参与内源性生物钟调节，影响GnRH分泌[12]。可见，时钟基因表达能够调节GT1-7细胞分泌活性，但并不改变脉冲式释放GnRH固有特性。

2.3离子通道对GT1-7细胞分泌调节

GT1-7细胞作为神经内分泌细胞，其分泌激素与细胞膜电位、胞内钙离子浓度和兴奋性等有关[13]。GT1-7细胞能表达多种质膜通道，有自发动作电位能力[14]：钠通道阻滞剂河豚毒素（TTX）敏感Na+通道[1]，三种不同类型向外K+通道和一个K+向内整流器[15-16]以及电压依赖性Ca2+通道[15,17]。GT1-7细胞自发动作电位频率24.8 min[18]与GnRH神经元平均脉冲频率25.8 min[5]基本一致，因此动作电位是GnRH释放机制一部分。GnRH分泌和钙振荡是“GnRH脉冲发生器”基础[19-20]，搏动机制是Ca2+周期性交替[21]。钙振荡与Na+通道动作电位和Ca2+通过电压门控钙通道有关[18]。K+通道阻滞剂能引起幅度或钙振荡频率明显变化[21]。GT1-7细胞能够表达R、L、N和T型钙通道[14]，其中R型亚基起关键作用，作为主要电流调节通道与L、N和T型钙通道共同调节GnRH释放[22]。近年来超极化激活环核苷酸调节通道（HCN）成为研究热点，HCN-在超极化时被激活并产生内向电流，目前发现有四种HCN通道亚型，即HCNl、HCN2、HCN3和HCN4，且四种亚型在GTl-7细胞上均有表达[23]。

Wetsel等研究发现，GT1-7细胞能表达缝隙连接蛋白，连接素26样蛋白[24]，及突触样连接蛋白[25]。目前研究发现GT1-7细胞分泌GnRH主要是分子生物学和电生理机制，但精确脉冲机制尚未确定，可能还包括经间隙连接旁分泌因子，例如一氧化氮、电生理耦合或GnRH及从GnRH前体分子加工而得到肽类物质，如GnRH相关肽（GAP）等。

3 GT1-7细胞在生殖相关研究中的应用

下丘脑接受中枢神经系统发布信息，通过GnRH神经元分泌GnRH，GnRH调节垂体中促性腺激素细胞分泌促卵泡素（FSH）和黄体生成素（LH），促性腺激素（FSH，LH）作用于性腺（雄性睾丸和雌性卵巢），调节性激素分泌并影响生殖活动。垂体分泌促性腺激素可反馈调节下丘脑GnRH分泌；性腺激素也可反馈调节下丘脑和垂体相应激素释放。因此，在下丘脑、垂体和性腺之间形成密切相连轴线系统，即HPG轴。体外GT1-7细胞不但能表现出与GnRH神经元类似脉冲分泌模式，还有GnRH、Kiss-1、GPR54、BMP受体、ERα、ERβ、抑制性Smads以及卵泡抑制素样蛋白等表达[26-27]。目前认为，GT1-7细胞是体外研究HPG轴调控机制的理想细胞模型。

3.1 GT1-7细胞与Kisspeptin/GPR54

Kisspeptin是Kiss-1基因编码神经内分泌肽类激素，为GPR54内源性配体[28]，可直接作用于下丘脑GnRH神经元，促进GnRH分泌，激活HPG轴。Kiss-1/GPR54基因突变可导致特发性促性腺激素分泌不足型腺机能减退症（Idiopathic hypogo⁃nadotropic hypogonadism, IHH）[29]，因此Kisspeptin/ GPR54被认为是青春期发育启动“分子阀门”。Kis⁃speptin处理GT1-7细胞，以浓度依赖性方式增加GnRH mRNA表达及GnRH分泌[27]。Ozcan等研究表明，Kisspeptin可使GT1-7细胞过表达GPR54，激活cAMP/PKA信号通路[30]，诱导GnRH受体表达。同时，Kisspeptin在Kisspeptin/GPR54系统保护机制下升高细胞内钙水平，通过Ca2+/PKC信号调控GnRH分泌[30]。Terasaka等通过RT-PCR证实Kiss⁃peptins/GPR54系统在GT1-7神经元细胞表达，但体内GnRH神经元并未表达，有GPR54表达[27]。因此，Kisspeptins刺激促性腺激素释放可能通过GPR54表达实现。Heather等对哺乳动物研究也证实Kisspeptins通过活化GPR54，使GnRH神经元表达GPR54，刺激下丘脑GnRH释放[31]。总之，Kiss⁃peptin/GPR54是青春期启动催化剂，进一步研究可以利用GT1-7细胞为模型探究下丘脑GnRH细胞如何调控HPG轴以及青春期启动等现象。

3.2 GT1-7细胞与E2/ER

动物体内研究表明，温和地持续注射雌激素（E2）（50 μg·kg-1，5 d）[32]及大剂量一次性注射雌激素（10 mg·kg-1）[33]，均能诱发大鼠真性性早熟。给卵巢摘除小鼠连续外源注射雌激素，可诱导GnRH和LH峰产生[34]。在体外用雌激素处理GT1-7细胞，pmol级浓度雌激素可对cAMP产生急速、持续、剂量依赖性抑制，而nmol级浓度雌激素可增加cAMP产生[35]。虽然GT1-7细胞表达ERα和ERβ，但小鼠GnRH神经元表达ERβ，却不表达ERα[36-37]。有研究报道GT1-7细胞中雌激素可能通过激活ERβ活性引起GPR54表达[38]。Tonsfeldt等研究还发现kiss⁃peptin引起GnRH分泌可能部分依赖雌激素活性，当雌激素水平升高时，增加kisspeptin可引起ERα 和ERβ mRNA表达，雌激素也能增加GnRH神经元对kisspeptin敏感性，加强GPR54表达[38]。E2能正负调控下丘脑GnRH神经元，启动初情期或正常生殖周期，GT1-7细胞已广泛用于E2生殖调控研究。

3.3 GT1-7细胞与Leptin

瘦素（Leptin）作为脂肪分泌激素，作用于下丘脑，调节食物摄入和能量代谢，也是生殖系统重要代谢信号。只有当体内营养状态达到一定临界水平，足以满足生殖需要时，才能触发动物机体青春期启动。Leptin对生殖活动调节主要通过调节下丘脑GnRH分泌实现。因肥胖基因突变而致原发性瘦素缺失ob小鼠出现肥胖并伴有生殖功能低下，通过单纯控制饮食可使体重下降，但不能恢复生育能力，而外原性瘦素可使其恢复[39-40]。杨颖等研究表明，GT1-7细胞表达Leptin受体基因，Leptin能促使GT1-7细胞迅速释放GnRH，呈明显量效关系，Leptin可能通过直接作用于下丘脑GnRH神经元，对生殖功能起调节作用[41]。虽然现有研究表明Leptin可直接调节GnRH分泌，但是在GnRH神经元上并未发现Leptin受体表达，表明Leptin对GnRH存在中间调节机制[42]。在下丘脑视前区，nNOS神经元上存在Leptin受体，NOS酶活性受Leptin调节。敲除Leptin基因小鼠（Lepob/ob）不育，在nNOS神经元选择性缺失Leptin可推迟雌鼠初情期启动，由于阻断Leptin信号传导经过nNOS细胞传至GnRH，nNOS-/-Lepob/ob小鼠在Leptin处理后缺乏LH分泌[43-44]。离体GT1-7细胞何时启动能量代谢调节，何时启动生殖机能调节，能否系统模拟动物机体生长发育过程尚不清楚。假设GT1-7细胞leptin受体基因缺失，通过提供外原性leptin，观察GT1-7细胞GnRH分泌情况，可研究能量对GnRH合成分泌以及生殖机能等影响。

3.4 GT1-7细胞与褪黑激素

褪黑激素（Melatonin，MLT）是普遍存在于动物机体的吲哚类激素，主要由松果体（Pineal gland，PG）合成和分泌，受光照调节。MLT可降低GnRH受体数量，抑制下丘脑GnRH分泌，主要通过HPG轴调控动物生殖活动。研究发现GT1-7细胞表达G蛋白偶联受体褪黑激素受体1（Mt1）和2（Mt2）[45]，抑制cAMP活性，激活PKC和AMPK活性而非PKA活性，抑制GT1-7细胞GnRH分泌[46]。MLT能提高立早基因c-fos和junB表达水平[46]。Kelestimur等研究结果表明MLT通过激活PKC增加细胞内Ca2+水平，抑制GT1-7细胞GnRH释放[47]。

在青春期与生殖功能调控研究中，胡雅婷发现脂联素通过AMPK和SP1调节GT1-7细胞Kiss-1基因表达[48]。GT1-7细胞表达脂联素受体1和2[49]、降钙素基因相关肽（CGRP）受体[50]、垂体腺苷酸环化酶激活多肽（PACAP）Ⅰ型受体[51]、神经激肽3受体（NKB3R）[52]等与生殖相关基因。

以上研究表明，GT1-7细胞与体内GnRH神经元相似，有多种生殖相关基因及其受体基因表达，可作为HPG轴调控机理理想细胞模型研究机体生殖活动。陈名道等研究中药补肾方二仙汤及其拆方对GT1-7细胞分泌GnRH影响[53]，揭示二仙汤及其拆方如何对下丘脑GnRH细胞发挥作用，调控HPG轴。

4影响GT1-7细胞活性信号通路

4.1 AMPK相关信号通路

腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK），即AMP依赖蛋白激酶，由α、β和γ亚基组成异源三聚体复合体，是生物机体重要信号分子、细胞能量关键传感器和调制器。AMPK活力主要通过调节其与催化相关结构元件实现。

AMPK通过接受上游信号调控活力，影响GT1-7细胞GnRH分泌。研究发现，GT1-7细胞中，胰高血糖素样肽-1受体（GLP-1R）活化后以时间依赖方式减少Akt磷酸化，可能通过PI3K-Akt信号通路调控AMPK活性，影响食物摄取[54]。在GT1-7细胞中，α-黑色素细胞刺激素（α-MSH）通过PKA-AMPK途径以调节能量消耗和食物摄取[55]；葡萄糖转运蛋白2（GLUT2）[56]通过改变细胞能量状态或AMP/ATP比率，调控食欲相关肽（AgRP）mRNA表达并使AMPK磷酸化葡萄糖；CGRP通过其受体下调GnRH mRNA表达[50]，激活cAMP-PKA通路而非cAMP-PKC通路抑制AMPK活性[12]，降低GnRH mRNA表达。

通过激活AMPK激动其下游信号调控GT1-7细胞GnRH分泌。球状域脂联素[57]通过AMPK-ERK，增加转录因子SPl表达或磷酸化，抑制GTl-7细胞Kiss-1基因启动子活性及其表达，影响GnRH分泌。GT1-7细胞中，球状脂连蛋白能激活AMPK磷酸化使乙酰辅酶A羧化酶（ACC）失活，使丙二酰CoA降低，增加AgRP mRNA表达，证明在下丘脑球状脂连蛋白调节能量平衡通过AMPK-ACC信号通路而非JAK-STAT3通路[58]，在泌乳奶牛饲喂苜蓿青贮粗饲料研究中发现，血清中胰岛素和脂联素浓度提高，激活奶牛乳腺胰岛素信号通路及JAK2-STAT信号通路[59]。Beall等研究发现，GT1-7神经元能表现出GE型葡萄糖传感行为并通过AMPKα2-UCP2通路实现[60]。

4.2 MAPK相关信号通路

丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）是一组可被不同细胞外刺激，如细胞因子、神经递质、激素、细胞应激及细胞黏附等激活丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶。MAPK信号转导通路存在于大多数细胞内，能将细胞外刺激信号转导至细胞及其核内，并引起细胞生物学反应。研究发现，在GT1-7细胞中，E2能活化ERK1/2和SAPK/JNK信号通路，但不激活p38MAPK信号通路[26]。Hayes等研究发现[61]，利用胰高血糖素样肽1（GLP-1）类似物Exendin-4，能通过激活PKA抑制AMPK并激活MAPK信号通路诱导胰高血糖素样肽1受体（GLP-1R）表达，抑制食物摄入量。研制药物抑制GLP-1R表达，可有效治疗肥胖症。Terasaka等研究表明，在GT1-7神经元细胞中，Kisspeptin能够刺激MAPK-AKT信号，与ERK信号在功能上参与GnRH mRNA表达[27]。

在GT1-7细胞中，是否存在除AMPK及MAPK相关信号通路以外信号转导，使一些神经递质或激素能通过多条信号通路传导共同作用影响GT1-7细胞分泌活性，尚需要深入研究。

5展　望

在脊椎动物脑组织中，一些激素和神经递质通过作用于GnRH神经元调控性腺轴。因此，GnRH神经元是这些物质调控性腺轴共同通路。刘金玲等研究发现，蛋氨酸脑啡肽（MENK）能促进小鼠骨髓来源树突状细胞TLR-4和TNF-α表达[62]，GT1-7细胞能否表达MENK受体，如何调控免疫系统有待进一步探讨。在体内研究中，神经元之间联系复杂，难以判断其直接作用抑或通过中间神经元间接作用于该GnRH神经元，利用下丘脑永生GnRH神经元细胞系GT1-7细胞可解决该问题。GT1-7细胞作为GnRH神经元理想细胞模型，在研究过程中取得突破，体外培养GT1-7细胞也更易于试验。但随着研究深入，GT1-7细胞模型局限性逐渐凸显。该细胞保持单一细胞克隆特性，只能代表一种GnRH神经元行为特点，激酶或细胞因子参与细胞活性与细胞类型、细胞成熟程度有关，某些基因或受体表达与体内GnRH神经元不一致，能否系统而精确模拟动物机体生长发育过程中各种神经递质及调控因子相互作用有待探索。

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GT1-7 cells and its application in reproduction-related researches

FENG Tao1, WU Xiaomin1,2, XU Xiaoling1, BAI Jiahua1, SONG Yuqing1, XIAO Linli1, HAN Xiangmin2, LIU Yan1(1. Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Beijing 100097, China; 2. School of Animal Science and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China)

Abstract:GT1-7 cells were subset strains of GT1 cell lines, which were GnRH neuron cell line isloated from the hypothalamus of transgenic mice and had the typical characteristics of highly differentiated neuroendocrine cells. GnRH synthesis and release in hypothalamus played an important role in reproductive function. However, GnRH neurons were only thousands and discrete distribution in the brain, which leads more difficulties in studying in vivo. Currently, GT1-7 cell was widely using in reproduction-related research works as an ideal GnRH cell model in vitro. In this review, the source, characteristics, applications as well as signaling pathways influencing ability of GT1-7 cells were summarized to provide references for GnRH related researches.

Key words:GT1-7 cells; gonadotropin-releasing hormone; reproductive regulation；signaling pathway

*通讯作者:刘彦，研究员，研究方向为动物繁殖学。E-mail: liuyanxms@163.com

作者简介：冯涛（1980-），男，副研究员，博士，研究方向为动物生殖营养调控。E-mail: fengtao_gs@163.com

基金项目：国家自然科学基金项目（31501950）；北京市科技新星计划项目（Z141105001814046）；奶牛产业技术体系北京市创新团队

收稿日期：2015-06-29

中图分类号：R58

文献标志码：A

文章编号：1005-9369（2016）01-0102-07