体外诱导脐带血间充质干细胞向软骨细胞分化研究进展

李兴福　段莉　梁宇杰　熊建义　吴汉伟　王大平



体外诱导脐带血间充质干细胞向软骨细胞分化研究进展

李兴福段莉梁宇杰熊建义吴汉伟王大平

510182，广州医科大学(李兴福)；518035， 深圳市组织工程重点实验室、深圳市第二人民医院(段莉、熊建义、吴汉伟、王大平)；518035，北京大学深圳研究生院(梁宇杰)

摘要种子细胞是软骨组织工程三大要素之一。脐带血间充质干细胞(UCB-MSC)可被诱导转化为软骨细胞，具有构建组织工程化软骨的潜能，是目前软骨组织工程领域研究的新热点。UCB-MSC作为一种新型干细胞可用于临床治疗关节软骨缺损。该文就体外诱导UCB-MSC向软骨细胞分化研究进展作一综述。

关键词软骨组织工程；软骨细胞；脐带血间充质干细胞

软骨组织工程技术涉及种子细胞、支架材料和细胞因子[1]，临床上已用于修复关节软骨缺损，但由于种子细胞来源有限且体外扩增易发生去分化，极大地限制了软骨组织工程技术的发展。脐带血间充质干细胞(UCB-MSC)经体外诱导可向软骨细胞分化，有望解决软骨组织工程种子细胞的供应问题。

在不同诱导条件下，UCB-MSC不但可向不同谱系分化，还可跨胚层分化[2]。此外，UCB-MSC的免疫原性低，不易引起移植物抗宿主病。目前学者们对诱导UCB-MSC向软骨细胞分化的方法尚未达成统一共识，其机制也众说纷芸。

1诱导因子

众所周知，间充质干细胞(MSC)在增殖和分化过程中受到诱导因子的调控。诱导不同来源的MSC向软骨细胞分化需要各具特色的诱导因子，而目前用于诱导UCB-MSC向软骨细胞分化的诱导因子主要包括转化生长因子 (TGF)-β超家族、胰岛素样生长因子(IGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)等。

1.1TGF-β超家族

TGF-β超家族是MSC成软骨细胞诱导中常见的生长因子，包括 TGF-β、骨形态发生蛋白(BMP)、激活素和抑制素等，其中TGF-β与BMP最为常用。

TGF-β超家族可促进软骨细胞增殖，调节软骨细胞分化，并刺激软骨细胞合成胞外基质，在软骨形成过程中起到重要作用。TGF-β可促进转录因子SOX9表达,而SOX9可调控Ⅱ型胶原合成，这对软骨细胞分化至关重要，因此TGF-β具有诱导多种来源的MSC向软骨细胞分化的潜力[3-4]。Rey-Rico等[5]研究发现，复合于支架材料的TGF-β1缓释可诱导MSC向软骨细胞分化。然而，单纯TGF-β诱导易导致软骨细胞肥大化，不利于构建组织工程化软骨[6]。有研究[7]发现，FGF和甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)可抑制软骨细胞早期肥大化。因此，TGF-β与 FGF或PTHrP联合使用或可抑制UCB-MSC在分化过程中发生早期肥大化。

BMP在软骨形成过程中发挥重要作用，常用于诱导MSC向软骨细胞分化。BMP-2、BMP-4、BMP-6均具有诱导MSC向软骨细胞分化的功能，但并不能单独诱导MSC团块成功分化为软骨，而其与TGF-β联合使用可达到理想效果[8]。An等[9]联合使用BMP-6与TGF-β3诱导UCB-MSC向软骨细胞分化，取得理想效果。此外，BMP能促进软骨细胞增殖并启动其成熟过程[10],有利于组织工程化软骨的完善。

1.2IGF

IGF家族包括IGF-1和IGF-2，均可促进细胞增殖，且IGF-1作用较强。IGF-1不仅能促进软骨细胞增殖和成熟，而且可刺激软骨细胞合成基质蛋白多糖，并具有诱导MSC向软骨细胞分化的能力。 Zhong等[11]研究发现，IGF-1可促进软骨细胞增殖和成熟,但其也会使软骨细胞肥大化。Mara等[12]研究发现，IGF-1诱导UCB-MSC向软骨细胞分化的效率不如TGF-β3，表现为由IGF-1诱导的UCB-MSCⅡ型胶原、聚集蛋白聚糖和SOX9表达水平低于由TGF-β3诱导的UCB-MSC,尤其是在UCB-MSC微球诱导体系，IGF-1的劣势更为明显。目前学者们对IGF-1诱导MSC成软骨机制尚不完全清楚。

1.3FGF

FGF可促进软骨细胞和MSC增殖，其中碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的应用最为广泛。bFGF可促进软骨细胞分泌基质蛋白，并阻止蛋白聚糖降解，故常用于构建组织工程化软骨。在诱导MSC向软骨细胞分化时，bFGF常与TGF、BMP及IGF等联合使用，可有效促进MSC向软骨细胞分化并维持软骨细胞表型[13]。FGF家族在促进MSC快速增殖的同时，还能保持MSC的多向分化能力，故可用于MSC培养扩增阶段。

1.4其他诱导因子

除上述诱导因子外，PTHrP、胰岛素、白细胞介素(IL)-10、肿瘤坏死因子 (TNF)-α等也具有成软骨诱导作用[14-15]。目前学者们认为可采用多种诱导因子协同作用来诱导MSC向软骨细胞分化，以避免单独使用诱导因子造成的不良结果，如联合使用TGF-β3、BMP-6及bFGF可高效诱导MSC向软骨细胞分化，同时使用PTHrP可抑制软骨细胞早期肥大化，或可构建理想组织工程化软骨。

2软骨细胞与UCB-MSC共培养

共培养技术可高效诱导MSC向软骨细胞分化，已被广泛应用于构建组织工程化软骨，且取得显著效果。在共培养体系中，软骨细胞分泌TGF-β刺激转录因子SOX9表达，从而促进MSC向软骨细胞分化，同时MSC分泌FGF刺激软骨细胞增殖及胞外基质合成分泌[16-17]。由此可知，共培养体系可诱导UCB-MSC向软骨细胞分化。Zuo等[18]在体外将大鼠软骨细胞和MSC分别进行直接共培养和间接共培养，3周后采用流式细胞仪分离两种细胞并进行检测，结果提示直接共培养组软骨细胞SOX9、Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖表达水平明显高于间接共培养组，且两组软骨细胞SOX9、Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖表达水平高于MSC；因此认为在共培养体系中软骨细胞与MSC之间相互作用，且MSC促进软骨细胞形成基质蛋白的作用强于软骨细胞对MSC的诱导作用，MSC与软骨细胞直接物理接触在促进软骨基质蛋白表达中起到更重要的作用。

目前共培养体系中细胞接种密度、接种比例、培养时间及理化因素干预等方面均存在争议，而应用共培养技术诱导UCB-MSC向软骨细胞分化面临诸如UCB-MSC培养成功率低等问题。为获得优质足量的透明软骨细胞，还需对共培养体系进行深度探讨。

3转基因技术

转基因技术不仅可以诱导MSC定向分化，还能规避诸多风险，并在体内外持续作用，提高MSC分化效率，因此其逐渐成为软骨组织工程领域的研究热点。用于软骨组织工程的基因常能表达具有软骨诱导作用的生长因子如TGF-β、IGF、BMP等，以及调控软骨发育的转录因子如SOX9、血小板反应蛋白(TSP)-2、音猬因子(Shh)等。Odabas等[19]研究发现，原代软骨细胞经BMP-7转染后，分泌基质能力和增殖能力均有明显增强，BMP-7转染组形成的软骨优于非BMP-7 转染组。Wang等[20]研究发现，转染SOX9的UCB-MSC高表达聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原，提示短期SOX9过表达可促进UCB-MSC向软骨细胞分化。Jeong等[21]采用血小板反应蛋白(TSP)-2 siRNA转染人类UCB-MSC，发现TSP-2可经Notch信号转导通路促进人类UCB-MSC向软骨细胞分化，并能抑制人类UCB-MSC肥大化，且不同来源的MSC向软骨细胞分化的潜力受细胞内TSP-2表达水平的影响；因此认为细胞内TSP-2表达水平可作为筛选优质MSC的参考标准。

目前转基因技术用于促进UCB-MSC向软骨细胞分化仍存在诸多问题，如操作过程中细胞损伤，生长因子长期过表达可引起细胞异常生长等。只有妥善解决以上问题，才能将转基因技术更好地推广到软骨组织工程领域。

4三维培养

三维环境有利于充分发挥细胞间的相互作用，且能容纳高密度的细胞黏附，有利于细胞增殖，而支架材料可为软骨细胞生长提供良好的三维环境，因此在诱导MSC向软骨细胞分化过程中经常使用。Yang等[22]利用琼脂糖支架间接共培养MSC与软骨细胞15 d，发现63∶1(软骨细胞∶MSC)的培养比例更有利于细胞合成聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原。Kang等[23]应用聚乙醇酸/聚乳酸(PGA/PLA)支架建立MSC与软骨细胞直接共培养体系，体外培养8周，结果除1∶9(软骨细胞∶MSC)共培养组外，其余各组均发生软骨样改变，5∶5(软骨细胞∶MSC)共培养组表现尤为突出；在裸鼠皮下培养6周后, 单纯软骨细胞培养组和5∶5共培养组都有明显软骨样改变，且5∶5共培养组表现出更好的均质性；体内培养6周组较体外培养8周组具有更好的力学性能，其中体内5∶5共培养组杨氏模量达到(4.52±0.41) MPa，接近于正常软骨组织。以上研究提示三维共培养体系可高效诱导MSC向软骨细胞分化。

通过支架材料协调生长因子与细胞之间的相互作用以促进MSC向软骨细胞分化，备受学者们的关注。胶原蛋白水凝胶在人体环境内能保持初期的形状和力学性能，有望用于制作人造软骨和人造椎间盘等，并能作为 “基座材料”构建UCB-MSC三维诱导体系，促进细胞分化和组织形成。

5力学刺激

关节软骨在正常生理状态下会受到各种力学刺激(如压力、剪切力等)。力学刺激通过改变细胞内第二信使(NO或Ca2+)的浓度，影响TGF、IL-1、IL-6及TNF等的表达，从而影响MSC向软骨细胞分化，进而影响软骨修复[24]。Song等[25]对40只成年雄性大鼠建立两侧股骨髁部髌骨沟全层软骨缺损模型，并随机分为4组，制动组术后不给予运动刺激，其余3组分别在术后2、4和8周开始给予适度运动刺激，各组一半大鼠在术后10周被处理并检测，另一半在术后14周被处理并检测，结果术后4周开始接受运动刺激的大鼠软骨修复效果最好，术后8周开始接受运动刺激的大鼠软骨修复效果最差。以上研究提示，时机适宜的力学刺激有利于软骨损伤修复，而过早或过晚的力学刺激不利于软骨损伤修复。因此，在促进软骨损伤修复时，应注意把握力学刺激的时机。

力学刺激可促进MSC向软骨细胞分化，但最佳施力大小、时机、方式等尚不明确，需进一步研究。此外，低氧环境、弱激光刺激等也具有软骨诱导作用[26-27]，因此在诱导UCB-MSC向软骨细胞分化过程中可联合物理因素干预，以提高诱导率。

6展望

目前利用UCB-MSC构建组织工程化软骨存在诸多问题。首先，UCB-MSC的提取培养成本较高，且原代培养成功率较低；其次，UCB-MSC体外培养周期较长，易发生分化；最后，UCB-MSC冻存复苏技术不成熟，长期储存UCB-MSC的难度较大[28-29]。 共培养体系诱导UCB-MSC定向分化的效率高且成本低，但UCB-MSC与软骨细胞之间的相互作用机制及其调节机制尚不完全清楚。随着对软骨发育调控机制的深入了解，更多的技术和方法将被引入这一领域，从而解决以上难题，促进软骨组织工程技术的发展。

参考文献

[1]徐伟力,朱伟民,黄江鸿,等. 软骨组织工程支架材料研究进展[J]. 国际骨科学杂志, 2014, 35(4):247-249.

[2]Onoyama S, Qiu L, Low HP, et al. Prenatal maternal physical activity and stem cells in umbilical cord blood[J]. Med Sci Sports Exerc, 2016, 48(1):82-89.

[3]Kondo M, Yamaoka K, Tanaka Y. Acquiring chondrocyte phenotype from human mesenchymal stem cells under inflammatory conditions[J]. Int J Mol Sci, 2014, 15(11):21270-21285.

[4]Sakaki-Yumoto M, Katsuno Y, Derynck R. TGF-β family signaling in stem cells[J]. Biochim Biophys Acta, 2013, 1830(2):2280-2296.

[5]Rey-Rico A, Venkatesan JK, Sohier J, et al. Adapted chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cells via controlled release of TGF-β1 from poly(ethylene oxide)-terephtalate/poly(butylene terepthalate) multiblock scaffolds[J]. J Biomed Mater Res A, 2015, 103(1):371-383.

[6]Mueller MB, Fischer M, Zellner J, et al. Hypertrophy in mesenchymal stem cell chondrogenesis: effect of TGF-beta isoforms and chondrogenic conditioning[J]. Cells Tissues Organs, 2010, 192(3):158-166.

[7]Weiss S, Hennig T, Bock R, et al. Impact of growth factors and PTHrP on early and late chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cells[J]. J Cell Physiol, 2010, 223(1):84-93.

[8]Lakhani HA, de Mel A, Seifalian AM. The effect of TGF-β1 and BMP-4 on bone marrow-derived stem cell morphology on a novel bioabsorbablenanocomposite material[J]. Artif Cells Nanomed Biotechnol, 2015, 43(4):230-234.

[9]An JH, Park H, Song JA, et al. Transplantation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells or their conditioned mediumprevents bone loss in ovariectomized nude mice[J]. Tissue Eng Part A, 2013, 19(5-6):685-696.

[10]Yang J, Shi P, Tu M, et al. Bone morphogenetic proteins: relationship between molecular structure and their osteogenic activity[J]. Food Sci Hum Well, 2014, 3(3-4):127-135.

[11]Zhong L, Huang X, Karperien M, et al. The regulatory role of signaling crosstalk in hypertrophy of mscs and human articular chondrocytes[J]. Int J Mol Sci, 2015, 16(8):19225-19247.

[12]Mara CS, Duarte AS, Sartori A, et al. Regulation of chondrogenesis by transforming growth factor-beta 3 and insulin-like growth factor-1 from human mesenchymal umbilical cord blood cells[J]. J Rheumatol, 2010, 37(7):1519-1526.

[13]Du M, Liang H, Mou C, et al. Regulation of human mesenchymal stem cells differentiation into chondrocytes in extracellular matrix-basedhydrogel scaffolds[J]. Colloids Surf B Biointerfaces, 2014, 114:316-323.

[14]Jagielski M, Wolf J, Marzahn U, et al. The influence of IL-10 and TNFα on chondrogenesis of human mesenchymal stromal cells in three-dimensional cultures[J]. Int J Mol Sci, 2014, 15(9):15821-15844.

[15]Zhang W, Chen J, Zhang S, et al. Inhibitory function of parathyroid hormone-related protein on chondrocyte hypertrophy: the implication forarticular cartilage repair[J]. Arthritis Res Ther, 2012, 14(4):221.

[16]Rothenberg AR, Ouyang L, Elisseeff JH, et al. Mesenchymal stem cell stimulation of tissue growth depends on differentiation state[J]. Stem Cells Dev, 2011, 20(3):405-414.

[17]Wu L, Leijten J, van Blitterswijk CA, et al. Fibroblast growth factor-1 is a mesenchymal stromal cell-secreted factor stimulating proliferation of osteoarthritic chondrocytes in co-culture[J]. Stem Cells Dev, 2013, 22(17):2356-2367.

[18]Zuo Q, Cui W, Liu F, et al. Co-cultivated mesenchymal stem cells support chondrocytic differentiation of articular chondrocytes[J]. Int Orthop, 2013, 37(4):747-752.

[19]Odabas S, Feichtinger GA, Korkusuz P, et al. Auricular cartilage repair using cryogel scaffolds loaded with BMP-7-expressing primary chondrocytes[J]. J Tissue Eng Regen Med, 2013, 7(10):831-840.

[20]Wang ZH, Li XL, He XJ, et al. Delivery of the Sox9 gene promotes chondrogenic differentiation of human umbilical cord blood-derivedmesenchymal stem cells in an in vitro model[J]. Braz J Med Biol Res, 2014, 47(4):279-286.

[21]Jeong SY, Ha J, Lee M, et al. Autocrine action of thrombospondin-2 determines the chondrogenic differentiation potential and suppresses hypertrophic maturation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells[J]. Stem Cells, 2015, 33(11):3291-3303.

[22]Yang YH, Lee AJ, Barabino GA. Coculture-driven mesenchymal stem cell-differentiated articular chondrocyte-like cells support neocartilagedevelopment[J]. Stem Cells Transl Med, 2012, 1(11):843-854.

[23]Kang N, Liu X, Guan Y, et al. Effects of co-culturing BMSCs and auricular chondrocytes on the elastic modulus and hypertrophy of tissueengineered cartilage[J]. Biomaterials, 2012, 33(18):4535-4544.

[24]范文帅,郭常安. 力学因素对间充质干细胞成软骨的研究进展[J]. 中华实验外科杂志, 2014, 31(7):1613-1615.

[25]Song JQ, Dong F, Li X, et al. Effect of treadmill exercise timing on repair of full-thickness defects of articular cartilage by bone-derivedmesenchymal stem cells: an experimental investigation in rats[J]. PLoS One, 2014, 9(3):e90858

[26]Schrobback K, Malda J, Crawford RW, et al. Effects of oxygen on zonal marker expression in human articular chondrocytes[J]. Tissue Eng Part A, 2012, 18(9-10):920-933.

[27]Kushibiki T, Tajiri T, Ninomiya Y, et al. Chondrogenic mRNA expression in prechondrogenic cells after blue laser irradiation[J]. J Photochem Photobiol B, 2010, 98(3):211-215.

[28]Pham PV, Vu NB, Pham VM, et al. Good manufacturing practice-compliant isolation and culture of human umbilical cord blood-derivedmesenchymal stem cells[J]. J Transl Med, 2014, 12:56.

[29]Sun HP, Zhang X, Chen XH, et al. Human umbilical cord blood-derived stromal cells are superior to human umbilical cord blood-derivedmesenchymal stem cells in inducing myeloid lineage differentiation in vitro[J]. Stem Cells Dev, 2012, 21(9):1429-1440.

(收稿: 2016-02-24; 修回: 2016-04-07)

(本文编辑: 卢千语)

基金项目：国家自然科学基金(81572198、81260161、81000460)、广东省医学科研基金(A2016314)、深圳市科技创新委员会基础研究布局项目(JCYJ20160301111338144)、深圳市科技创新委员会技术攻关项目(JSGG20140519105550503)

通信作者：王大平E-mail: dapingwang1963@qq.com

DOI：10.3969/j.issn.1673-7083.2016.04.011