牙龈蛋白及其对破骨和成骨细胞功能的影响

侯玉帛　刘歆婵　于海燕　崔磊华　于维先

1.吉林大学口腔医院牙周科　长春 130021；2.吉林大学口腔医院种植科　长春 130021；3.吉林大学口腔医院口腔颌面外科　长春 130021；4.吉林省牙发育及颌骨重塑与再生重点实验室　长春 130021

牙龈蛋白及其对破骨和成骨细胞功能的影响

侯玉帛1刘歆婵2于海燕1崔磊华3于维先4

1.吉林大学口腔医院牙周科长春 130021；2.吉林大学口腔医院种植科长春 130021；3.吉林大学口腔医院口腔颌面外科长春 130021；4.吉林省牙发育及颌骨重塑与再生重点实验室长春 130021

牙龈卟啉单胞菌分泌的牙龈蛋白作为牙周病的一种重要的毒力因子，一方面通过降解骨保护蛋白（OPG）及促进核因子-κB（NF-κB）受体活化因子配体（RANKL）的释放激活OPG/RANKL/NF-κB受体活化因子信号转导通路，进而诱导破骨细胞前体细胞向破骨细胞分化，增强破骨细胞功能；另一方面，牙龈蛋白可通过线粒体依赖性内在程序性细胞死亡通路和肿瘤坏死因子受体家族介导的外在程序性细胞死亡通路诱导成骨细胞程序性细胞死亡，抑制成骨细胞功能，最终导致牙槽骨丧失。本文就近年来牙龈蛋白及其对破骨和成骨细胞功能的影响相关研究进展作一综述。

牙龈卟啉单胞菌；牙周炎；牙龈蛋白；成骨细胞；破骨细胞

This study was supported by the Jilin Province Health Department Funding Projects（20102045），Jilin Province Development and Reform Commission Funded Projects（2013C022-4） and Jilin Province Department of Funded Projects（20150101076JC）.

［Abstract］Gingipains are cysteine proteases produced by Porphyromonas gingivalis，one of the major virulent agents of periodontal diseases. On the one hand，gingipains promote the differentiation of osteoclasts to enhance osteoclast function by activating the osteoprotegerin（OPG）/receptor activator of nuclear factor-κB（NF-κB） ligand（RANKL）/receptor activator of the NF-κB signaling pathways through degradation of OPG and induction of RANKL. On the other hand，gingipains inhibit osteoblast function by inducing osteoblast apoptosis through the external pathway mediated by the tumor necrosis factor receptor family and the mitochondrial pathway. These effects eventually lead to alveolar bone loss. This paper presents recent progress on gingipains and their effects on the functions of osteoclasts and osteoblasts.

［Key words］Porphyromonas gingivalis；periodontitis；gingipains；osteoclasts；osteoblasts

牙龈卟啉单胞菌是牙周炎的重要致病菌，能产生脂多糖、脂磷壁酸、菌毛和牙龈蛋白等多种毒力因子，其毒性成分中蛋白质水解活性的85%以上来自牙龈蛋白［1］。牙龈蛋白是一种半胱氨酸蛋白酶，是目前公认的牙龈卟啉单胞菌的主要毒力因子。Pathirana等［2］通过对小鼠牙周炎模型的研究后证实，牙龈蛋白参与牙周炎引起的牙槽骨吸收这一病理变化。本文就牙龈蛋白及其对破骨和成骨细胞功能的影响等相关研究进展作一综述。

1　牙龈蛋白

牙龈蛋白是一组由牙龈卟啉单胞菌分泌在外膜、膜泡或胞外的半胱氨酸蛋白酶，也称为牙龈蛋白酶，为梭菌蛋白酶家族成员之一［3］。根据其特异性切割位点的不同，牙龈蛋白可分为精氨酸特异性牙龈蛋白酶（arginine gingipain，Rgp）和赖氨酸特异性牙龈蛋白酶（lysine gingipain，Kgp）。Rgp又进一步分为RgpA和RgpB，分别由rgpA和rgpB基因编码，其相对分子质量分别为9.5×104和5.0×104；Kgp由kgp基因编码，其相对分子质量为1.05×105 ［4］。RgpA和Kgp的结构具有相似性，包括一个信号肽、N-末端结构域、精氨酸或赖氨酸特异性催化结构域、免疫球蛋白超家族域和C-末端血凝蛋白/黏附区域。RgpB是一种位于细胞膜外的单体蛋白，与RgpA的催化结构域具有高度序列同源性，但RgpB的C-末端缺乏血凝蛋白/黏附区域。

牙龈蛋白在分泌及成熟的过程中，它们各自的催化结构域形成稳定的络合物，能特异性结合并水解靶目标。RgpA和Kgp的C-末端血凝蛋白/黏附区域通过非共价键互相结合，主要促进细菌对细胞外基质蛋白和宿主细胞的黏附；而免疫球蛋白超家族域的存在使其具有免疫原性，可被宿主免疫系统识别。有研究［5］显示，给予牙周炎模型小鼠接种Kgp催化结构域与RgpA和Kgp血凝蛋白/黏附区域复合物疫苗后，能有效减轻牙槽骨丧失。他们认为，牙龈蛋白在牙龈卟啉单胞菌诱导的牙周炎病理性牙槽骨吸收中起到重要的作用。

2　牙龈蛋白对破骨细胞功能的影响

牙周炎病理性牙槽骨吸收是破骨细胞功能增强使骨吸收增加，或成骨细胞功能减弱使骨新生减少，或两者并存致牙槽骨代谢平衡失调，使骨吸收大于骨形成的结果。破骨细胞是由来源于骨髓造血干细胞的单核-巨噬细胞谱系前体细胞融合而成的多核巨细胞，在炎性条件下，破骨细胞的分化受核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）、骨保护蛋白（osteoprotegerin，OPG）、NF-κB受体活化因子（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）、Toll样受体和炎性细胞因子等多种因素调控。RANK是RANKL的功能性受体，当二者结合后，可引发细胞内信号级联反应，诱导破骨细胞成熟和分化；而OPG为RANKL的诱饵受体，可竞争性地结合RANKL，抑制破骨细胞的形成。在牙周炎患者的牙周组织中，RANKL/OPG的比率是衡量牙槽骨丧失的重要指标之一，RANKL表达上调或OPG表达下调可致骨丧失增加［6］。目前发现，牙龈蛋白尤其是赖氨酸依赖性牙龈蛋白酶在诱导破骨细胞形成和分化进而引起牙槽骨吸收过程中起重要作用。

2.1牙龈蛋白直接诱导破骨细胞的分化

牙龈蛋白具有直接诱导破骨前体细胞向破骨细胞分化的功能，三种牙龈蛋白各自诱导破骨细胞分化能力分别为Kgp最强，RgpB次之，RgpA最弱［2］。Akiyama等［7］发现，在无骨吸收刺激因子存在的条件下，Kgp与骨髓单核细胞和成骨细胞共培养，Kgp可直接诱导骨髓单核细胞向破骨细胞分化，且随着Kgp浓度的升高，破骨细胞数量增多。位于Kgp催化结构域的Kgp467～477和位于RgpA和Kgp血凝蛋白/黏附蛋白结构域的RgpA1054～1064/ Kgp1074～1084为结合在细胞组织相容性复合体2类分子表面的多肽，是CD4阳性T淋巴细胞的抗原决定簇［8］。辅助型T细胞被牙龈蛋白激活后进一步促进B淋巴细胞分化为成熟浆细胞并释放特异性抗体，诱发宿主体液免疫反应；而在激活的CD4阳性T淋巴细胞与B淋巴细胞在巨噬细胞集落刺激因子或RANKL存在的条件下，可诱导破骨前体细胞向破骨细胞分化。RgpA缺陷型牙龈卟啉单胞菌株引起牙槽骨丧失的水平与野生型菌株无差异，故RgpA几乎没有直接诱导破骨细胞分化的能力。RgpB缺陷型牙龈卟啉单胞菌株可明显地减轻牙槽骨丧失的水平，但其作用弱于Kgp缺陷型。Yasuhara等［9］证实，RgpB与骨髓单核细胞和成骨细胞共培养时，没有诱导骨髓单核细胞向破骨细胞分化的能力。Grøn等［10］指出，血清中的α2-巨球蛋白可有效地抑制Rgp的活性，进而抑制RgpB诱导破骨细胞分化的能力，且α2-巨球蛋白对Kgp的活性无影响。Guo等［11］发现在犬种植体周围炎模型中，Kgp核酸疫苗相比RgpA和RgpB核酸疫苗更有效地增强机体免疫反应并减少骨吸收的程度，Kgp在诱导破骨细胞分化中起到主要作用。

2.2牙龈蛋白间接诱导破骨细胞的分化

牙龈蛋白可通过增强多种毒力因子的生物学功能间接地诱导破骨细胞前体细胞向破骨细胞分化。在牙龈卟啉单胞菌、中间普雷沃菌和福赛斯坦纳菌等细菌感染的牙周组织中存在着脂多糖、地诺前列酮（旧称前列腺素E2）、未甲基化的CpG DNA和肽聚糖等多种细菌分泌的毒力因子，这些因子均可促进牙周炎病理性的牙槽骨吸收［12］。Yasuhara等［9］发现在诱导骨髓单核细胞向破骨细胞分化的过程中，有Kgp存在的情况下较无Kgp存在时脂多糖的浓度低100%。此外，Kgp可以提高骨化三醇、脂多糖、未甲基化的CpG DNA和肽聚糖等分别通过维生素D，Toll样受体（Toil-like receptor，TLR）4、9以及核苷酸结合寡聚化结构域2信号转导通路诱导成骨细胞表达RANKL的能力，提高RANKL/RANK比值，促进骨髓单核细胞向破骨细胞分化。

在牙周组织炎症反应中，牙龈蛋白可激活凝血酶原形成凝血酶或者直接作为补体（complement，C）5转化酶［13］，将C5裂解为具有生物学活性的C5a，进一步激活C5a受体-TLR2信号转导通路，破坏机体免疫防御功能；而在此过程中一些公认的促进骨吸收的炎性细胞因子被激活，如白细胞介素（interleukin，IL）-1、6、17以及肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）α［14］。

Abe等［15］发现，给小鼠牙周炎模型应用C5a受体拮抗剂后可有效抑制牙龈卟啉单胞菌引起的牙槽骨吸收，减轻牙周组织炎症反应。在激活炎性细胞因子的同时，牙龈蛋白还作为蛋白水解酶可选择性地降解IL-6［16］和IL-17［7］，保留IL-1和TNFα，从而间接促进IL-1和TNFα诱导破骨细胞前体细胞向破骨细胞分化的能力；因此牙龈蛋白在影响宿主免疫防御反应的同时又促进部分毒力因子和炎性细胞因子诱导破骨细胞前体细胞向破骨细胞分化的能力，进而促进牙槽骨吸收。

2.3牙龈蛋白通过OPG/RANKL/RANK信号转导通路影响破骨细胞的功能

首先，Kgp通过有效降解OPG使其失去结合RANKL的活性，是其诱导破骨细胞前体细胞向破骨细胞分化重要途径之一。Akiyama等［7］发现，Kgp可在OPG的相应死亡结构域分解其二硫键同源二聚体，该结构是结合和抑制RANKL的关键，进而使OPG失去活性。Yasuhara等［9］在将Kgp与OPG基因缺陷型成骨细胞和骨髓单核细胞共培养时发现，Kgp诱导骨髓单核细胞向破骨细胞分化的作用不明显。其次，牙龈蛋白可通过蛋白酶激活受体途径刺激成骨细胞中RANKL表达，增加牙周炎组织周围RANKL的表达［17］。Akiyama等［7］通过研究还证实，Kgp与成骨细胞共培养时可通过增加RANKL mRNA的量使RANKL表达增多，而对RANK的表达无影响。牙龈蛋白Kgp和RgpA作为CD4阳性T淋巴细胞特异性抗原决定簇，可激活CD4阳性T、B淋巴细胞，这些细胞可通过直接分泌RANKL或间接分泌炎性细胞因子TNFα、IL-1和干扰素-γ等促进RANKL表达，进一步增加RANKL的量［18］。

除此之外，Kgp在有效降解OPG的同时可以提高RANKL的表达，使RANKL/OPG比率增加，增加RANKL/RANK结合率，进而激活RANK；RANK与接头蛋白TNF受体（TNF receptor，TNFR）相关因子（TNFR associated factor，TRAF）6结合，激活下游NF-κB信号转导通路，启动破骨细胞前体细胞内破骨细胞形成树突细胞-特异性跨膜蛋白、腺苷三磷酸6v0d2、破骨细胞相关受体和抗酒石酸酸性磷酸酶等基因的转录，促进破骨细胞的成熟和分化［19］。

3　牙龈蛋白对成骨细胞功能的影响

成骨细胞是参与骨代谢中骨形成的主要细胞。成骨细胞的增殖与程序性死亡对维持骨代谢平衡起着重要的作用，而成骨细胞程序性死亡的增加会进一步干扰成骨细胞功能，影响新骨生成。牙龈蛋白可诱导牙龈上皮细胞、牙龈成纤维细胞、内皮细胞和成骨细胞等程序性死亡，导致牙周结缔组织的破坏及牙槽骨组织的丧失，加重牙周炎病情。目前，成骨细胞程序性死亡主要由两条细胞内信号通路介导，即肿瘤坏死因子受体家族介导的外在程序性细胞死亡通路和B细胞白血病/淋巴癌（B cell lymphoma/leukmia，BCL）2家族成员介导的线粒体依赖性内在程序性细胞死亡通路。

有研究在牙龈蛋白与成骨细胞共培养过程中检测到BCL2家族的BH3域促程序性细胞死亡蛋白B细胞淋巴瘤-2细胞死亡调节蛋白（B cell lymphoma-2 interacting mediator of cell death，BIM）和B细胞淋巴瘤2相关死亡蛋白（BCL2-associated death，BAD）表达增高，进一步活化下游促程序性细胞死亡蛋白BCL2同源同源拮抗剂或杀手蛋白（BCL2 homologous antagonist-killer，BAK）和BCL2相关蛋白X（BCL2 associated protein X，BAX），最终激活半胱氨酸天冬酰胺特异蛋白酶（cysteinyl aspartale specific protease，caspase）-3 和caspase-7，诱导成骨细胞程序性死亡［20-21］，而抑制牙龈蛋白的活性，可有效抑制BIM和BAD的表达，减少成骨细胞程序性死亡。

Kgp通过增强炎性细胞因子TNFα的生物学功能，可促进TNFα与跨膜蛋白死亡受体脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FAS）、CD95、载脂蛋白1和TNFR1结合，增强caspase-3、8的活性，诱导成骨细胞程序性死亡［22］。抑制miRNA-23a和miRNA-17～92a［23］的表达，可有效促进TNFα诱导成骨细胞程序性死亡，进而抑制骨形成［24］。此外牙龈蛋白可诱导细胞周期G1期阻滞。程序性细胞死亡与细胞周期进程密切关联，Kato等［25］发现牙龈蛋白，尤其是Kgp可引起人成骨细胞周期G1期的阻滞，而G1期的阻滞使成骨细胞无法到达G1/S期分化位点，进而抑制成骨细胞增殖，最终导致程序性细胞死亡；因此，抑制牙龈蛋白的活性可有效保护成骨细胞，降低程序性细胞死亡水平，进而减少牙槽骨吸收。

4　结语

目前，有研究［26］合成的对Rgp和Kgp均有良好选择和抑制作用的新型抑制剂KYT-41，在犬牙周炎模型中表现出较好的治疗效果和安全性。相信随着对牙龈蛋白特别是Kgp的结构及其在牙周炎牙槽骨吸收中作用机制研究的深入，可以此为靶点为牙周炎这种难治性疾病提供全新的预防或治疗策略。

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（本文采编王晴）

Effect of gingipains on osteoclasts and osteoblasts

Hou Yubo1，Liu Xinchan2，Yu Haiyan1，Cui Leihua3，Yu Weixian4. （1. Dept. of Periodontics，Hospital of Stomatology，Jilin University，Changchun 130021，China；2. Dept. of Implantation，Hospital of Stomatology，Jilin University，Changchun 130021，China；3. Dept. of Oral and Maxillofacial Surgery，Jilin University，Changchun 130021，China；4. Key Laboratory of Mechanism of Tooth Development and Jaw Bone Remodeling and Regeneration in Jilin Province，Changchun 130021，China）

Q 51

A

10.7518/gjkq.2016.05.025

2015-12-07；［修回日期］2016-05-30

吉林省卫生厅资助项目（20102045）；吉林省发改委资助项目（2013C022-4）；吉林省科技厅资助项目（20150101076JC）

侯玉帛，硕士，Email：1163586460@qq.com

于维先，教授，博士，Email：yu-wei-xian@163.com