猪细小病毒病毒样颗粒研究进展

杜毅超,吴健敏,刘金凤

(1.广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530004; 2.广西兽医研究所动物疫病病原学与诊断重点实验室，广西南宁 530001)



文献综述

猪细小病毒病毒样颗粒研究进展

杜毅超1,2,吴健敏2*,刘金凤2

(1.广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530004; 2.广西兽医研究所动物疫病病原学与诊断重点实验室，广西南宁 530001)

摘要：猪细小病毒(PPV)是引起母猪繁殖障碍和仔猪死亡的主要病原，疫苗免疫预防是控制该病的主要手段。由于对生物安全的担心，目前国内使用的疫苗仍以灭活苗为主。病毒样颗粒(VLPs)疫苗以其安全性高、免疫原性好成为各类病毒疫苗研究的热门方向。猪细小病毒病毒样颗粒(PPV-VLPs)是不含PPV DNA的空衣壳结构，由PPV VP2结构蛋白体外自行组装形成，形态上与天然病毒粒子相似，具有很强的免疫原性和生物学活性。论文就VLPs疫苗的免疫机制及PPV-VLPs的组装及其在国内外的研究进行综述，为PPV- VLPs研究提供参考。

关键词：猪细小病毒；VP2；病毒样颗粒

猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)是一种高度稳定且持久感染的自主型病毒[1]。能引起怀孕母猪的繁殖性障碍，典型临床症状是胚胎和胎儿感染死亡，怀孕母猪流产、产死胎及木乃伊胎等，还引起仔猪皮炎、腹泻、非化脓性心肌炎和呼吸系统疾病[2-3]。PPV为细小病毒科(Parvoviridae)细小病毒属(Parvovirus)的单链DNA病毒，根据其遗传学特征可分为6型，即PPV-1、PPV-2、PPV-3、PPV-4、PPV-5[4-5]和PPV-6[6]。疫苗免疫仍是目前预防和控制PPV的重要措施，但现有疫苗不仅存在过敏反应、毒力返祖、细胞及体液免疫能力低下等缺陷，还存在病毒体外增殖困难、生产成本高及病毒扩散等问题。在PPV基因工程亚单位疫苗的开发方面，由于蛋白折叠错误及表达系统的低效，使得基于重组蛋白的亚单位疫苗的免疫原性往往很低，因此利用新技术开发安全、高效的新一代疫苗是当前亟待解决的问题[6]。

病毒样颗粒(VLPs)疫苗是基因工程亚单位疫苗研究的新方向，VLPs是由一种或多种病毒衣壳蛋白自行装配而成的空壳颗粒，不含病毒核酸，不能复制，没有感染性，形态结构上与天然病毒粒子相同或相似，即使没有佐剂也可刺激机体产生强烈的体液和细胞免疫[7]。迄今为止，VLPs可以在许多不同的表达系统(大肠埃希菌、酵母、植物细胞、哺乳动物细胞和昆虫细胞)有效表达并自行装配，已报道的VLPs有100多种以上[8]。VLPs疫苗以其安全性高、免疫原性强的优势展现出广阔的应用前景。

1　VLPs及其免疫机制

VLPs是由病毒的单个或多个核衣壳蛋白自行装配形成的规则超分子结构，有的含包膜，通常为二十面体或棒状结构，直径25 nm～100 nm[9-10]。VLPs的免疫原性和抗原性与病毒的核衣壳蛋白和包膜的结构特征有关。VLPs的空间结构能够允许其重复且高密度的展示病毒特有的病原相关分子模式(PAMPs)，PAMPs可以激活固有免疫反应，被Toll样受体(TLRs)及宿主细胞中其他模式识别受体(PRRs)识别，通过刺激抗原递呈细胞(APCs)包括巨噬细胞、树突状细胞(DCs)等进行抗原摄取，经加工后递呈给MHCⅡ类分子，促进DCs的成熟与迁移，诱导产生刺激分子，从而激活一系列的免疫应答[11]。一些外源性VLPs仍保留与天然病毒相似受体结合区域，可以被当做内源性抗原以交叉递呈的方式通过MHCⅠ类途径进行递呈,从而活化CD8+T细胞，实现CD8+T细胞介导的保护性免疫反应,这对于清除细胞内的病原体至关重要。APCs呈递抗原与抗原的大小、形状、表面电荷等有关，主要取决于抗原的大小。VLPs的形态大小也使其更适合被DCs捕获，定位于DCs的晚期内吞体[12-13]。

VLPs展示的多个B细胞和T细胞抗原表位，可通过MHCⅠ、MHCⅡ类途径进行抗原提呈，并且自身具有佐剂分子效应[12,14-16]，亦有些免疫原性较差的VLPs需要高效佐剂以增强免疫应答[17]。此外，VLPs可交联B细胞膜表面免疫球蛋白诱导强烈的B细胞反应，还可有效刺激CD4+T细胞的增殖和细胞毒性T细胞(CTL)反应[18]。在某些情况下，VLPs可以直接激活B细胞受体和刺激T细胞非依赖性IgM反应[19]。因此，低剂量的VLPs可以激活动物免疫系统的多种保护性反应，可大大的降低兽用疫苗的成本。

在安全方面，VLPs由于缺少病毒核酸，从而消除了病毒在复制、嵌合、返祖、重组和重配过程中的风险。利用不同表达系统制备VLPs也不会造成致病性病毒的传播，生产的疫苗也不存在毒力返祖、产生免疫缺陷的风险。

VLPs除了可以直接作为相应病毒的疫苗之外，还可以作为一种抗原递呈载体。通过基因工程技术将不同种(型)病毒蛋白基因插入或融合在一起形成嵌合病毒样粒子(cVLPs)。单个VLPs上嵌合多个免疫原性较低的可溶性抗原可以有效提高可溶性抗原的免疫原性。此外，还可以分别表达包括非蛋白类抗原在内的外源抗原和VLPs，再通过化学方法以共价或非共价的方式将其偶联至VLPs表面，也可在VLPs表面设计外源抗原的结合位点[20-21]。能结合到VLPs表面的抗原有短肽、环肽、全长蛋白等蛋白抗原以及多糖、半抗原等非蛋白抗原[22]。VLPs还可以作为一种有效的药物传递系统，将抗癌药物阿霉素(DOX)共价结合到轮状病毒VLPs表面，再连接上包含半乳糖的细胞靶向配体，可以被体内不同的细胞吸收。Zhao Q等[23]证明与VLPs结合的DOX与单一DOX相比，可以提高药物代谢动力学，还可以降低药物对细胞的毒性。在治疗慢性疾病如关节炎、阿尔茨海默病中治疗性VLPs疫苗展示出广阔的发展前景[24]。

2　PPV VLPs的研究现况

PPV是单股负链DNA病毒，无囊膜，病毒粒子大小22 nm～25 nm，由60个衣壳蛋白亚基组成，结构呈二十面体等轴对称[25]。PPV基因组大小约5.0 kb，末端约有120 bp～200 bp的回文结构(形状类似“Y”或“T”形)。研究表明，PPV基因组极为简洁，拥有2个启动子，通过可变剪接可高效表达7种蛋白，P4启动子控制非结构蛋白NS1、NS2及NS3的合成；P40启动子控制结构蛋白VP1和VP2的合成，VP2蛋白N端有9个连续甘氨酸富集区，是VP3蛋白的切割位点，VP3蛋白由VP2蛋白水解后而得；此外，VP2 mRNA还可表达一个非结构蛋白SAT[26-27]。VP2蛋白为衣壳蛋白主要成分，约占衣壳蛋白的90%，VP2蛋白有9个线性的B细胞抗原表位，能诱发抗PPV的特异中和抗体的抗原表位都位于N端。VP2基因易发生突变，一些关键位点(如第378、383、436和565位)的突变，对PPV是积极的选择，更利于PPV的存活[28]。

PPV VP2基因决定病毒的血凝活性、宿主范围和种属进化关系，不同毒株之间的差异均位于VP2基因；VP2蛋白对病毒的感染有极其重要的作用，用VP2的抗体封闭PPV易感宿主细胞，发现病毒丧失了对易感细胞的感染性。PPV衣壳蛋白亚基含有8个β转角、1个α螺旋和4个氨基酸loop区域(loop1:86-101 aa、loop2:212-245 aa、loop3:273-333 aa、loop4:413-424 aa)，loop区域是抗原位点所在区域[27]。这些抗原位点可以诱导机体产生中和抗体，保护机体免受病毒的攻击。Pan[29]等分别构建重组腺病毒(recombinant adenovirus，RAV)VP2 loop缺失突变株rAd-VP2 Δloop2、rAd-VP2 Δloop4、rAd-VP2 Δloop2-loop4，转染HEK-293细胞表达，结果loop4、loop2-loop4缺失突变株均很难表达出完整的PPV VLPs，而loop2缺失突变株则能装配出大量规则的PPV VLPs。

2.1PPV VLPs

Rymerson R T等[30]将PPV VP2基因插入植物双元表达载体，在转基因烟草中进行表达。结果从烟叶组织中提取到能自行组装成VLPs的VP2可融性蛋白，皮下免疫接种小鼠，小鼠产生中和抗体并得到保护，中和抗体滴度达1∶2 700以上。表明植物表达系统可以制备VLPs疫苗。

Tamosiunas R P等[31]利用酿酒酵母表达系统表达PPV VP2蛋白，制备了9种抗VP2蛋白的单克隆抗体(MAb)，经间接ELISA检测，MAb的敏感性和特异性分别为93.4%和97.4%，酿酒酵母表达系统在制备诊断用PPV VLPs展示了令人鼓舞的应用前景。Guo C等[32]筛选毕赤酵母蛋白酶缺陷株表达VP2蛋白，通过优化表达时间，获得595.76 mg/L的高水平表达。

杆状病毒-昆虫细胞表达系统是最常用的表达体系。早在1992年，Martinez C等[33]将PPV VP2基因克隆到杆状病毒表达系统中，并在昆虫细胞中高效表达，表达的VP2 蛋白能自行装配成VLPs，用3 μg的重组抗原配1.5 μg的佐剂制成疫苗，免疫母猪能诱导产生强烈的免疫应答。Antonis A F G等[6]用昆虫/杆状病毒表达系统大规模制备PPV-VLPs，测试其免疫原性及保护效果，结果不足微克的VLPs制成油包水油乳剂苗免疫豚鼠后，诱发高水平的抗体滴度；0.7 μg的VLPs单次免疫仔猪能完全抵抗PPV强毒株的攻击。利用His标签可以高效纯化蛋白，Zhou H等[34]将带有His标签的VP2基因嵌入pFastbac1载体构建重组质粒pFastPVP2和重组杆粒B-pFastPVP2并分别转入大肠埃希菌和sf9昆虫细胞中表达，经Ni-NTA亲和层析纯化蛋白，电镜观察到直径20 nm～30 nm球形粒子，血凝试验可知重组VP2蛋白的血凝滴度达到1∶8 192，且昆虫细胞表达系统表达的VP2蛋白可以用于建立ELISA，而大肠埃希菌表达系统则不能。

2.2嵌合多表位PPV VLPs

PPV VLPs可以与外源抗原嵌合，为开发预防和控制猪病的多联苗提供了可能。Hong H等[35]将PPV VP2基因和口蹄疫病毒(FMDV)衣壳蛋白前体P1-2A基因融合后和伪狂犬病病毒(PRV) TK-/gE-/LacZ+基因缺失疫苗株的基因组共转染PK-15细胞，获得了重组病毒PRV TK-/gE-/P1-2A-VP2，以106TCID50的重组病毒免疫小鼠后，用107TCID50PRV Ea株攻毒，结果小鼠获得完全保护。Pan Q等[36]将猪圆环病毒2型(PCV2) 编码Cap蛋白抗原表位165-200 aa的基因嵌合到PPV VP2基因5′端，通过HEK-293细胞组装成VLPs，VLPs形态大小和血凝性都与PPV全病毒粒子相似，PPV VP2 N端缺失并不影响VLPs的组装，这种嵌合型VLPs为研究能同时预防PCV和PPV的疫苗提供了可能。Xu Z W等[37]将PCV2 ORF2(700 bp)插入到PPV VP2基因3′端1 215 bp～1 216 bp处，并转染到COS-7细胞，分析表达产物没有发现VLPs，通过对PPV衣壳蛋白三维结构分析发现，在PPV VP2基因3′端插入外源基因，可能会影响VLPs的形成，但也不排除由插入片段过大造成。Chen Y等[38]成功构建含有PPV VP2基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因以及PRV TK-/gE-/gI-/LacZ+基因直径约为150 nm的重组伪狂犬病病毒(PRV SA215/VP2)粒子和30 nm～40 nm的PPV空衣壳；仔猪免疫保护试验表明5×105TCID50的重组病毒免疫仔猪，能诱导仔猪和分娩母猪产生对PPV和PRV的特异性体液免疫应答，并能完全抵御PPV和PRV Fa强毒株的攻击。Rodriguez[39]等将带有CD8+T细胞表位(SYVPSAEQI)的疟原虫环子孢子蛋白(CSP)基因与PPV VP2基因融合转染sf9细胞获得的重组PPV VLPs提高了免疫原性，能够诱导特定的CD8+T细胞反应，2 d内就能使寄生在肝中的疟原虫环子孢子减少95%。蒋春英等[40]将日本脑炎病毒((JEV) E蛋白中编码的B细胞表位及T细胞表位序列，连接到PPV VP2基因的5′端，转化大肠埃希菌BL21(DE3)后，成功表达了重组蛋白，Western blot分析表明，表达产物能分别被抗JEV多克隆抗体和抗PPV多克隆抗体识别，电镜观察显示，N端连接JEV多表位肽的PPV VP2蛋白能够在体外组装成有活性的VLPs。潘群兴等[41]将具有空间构象的O型FMDV VP1多表位基因 (VP1：21-40、141-160、200-213残基)插入并替换PPV VP2蛋白表面不同Loop区的部分基因序列，并在VP2蛋白N端引入通用型辅助性T淋巴细胞表位(PADRE)，人工合成嵌合基因并克隆到杆状病毒转移载体pFastBac HAT中，转化到大肠埃希菌DH10Bac 感受态细胞，获得重组杆状病毒质粒并转染sf9细胞后，电镜观察到重组蛋白能自行组装成VLPs，红细胞凝集试验证实具有与全病毒类似的血凝活性；此后，Pan Q等[42]将嵌合基因重组到腺病毒载体上并在HEK-293细胞中表达，在不影响VLPs组装的情况下，PPV VP2蛋白的loop区可以嵌入57个氨基酸，分别用5×105TCID50的重组腺病毒和100 μg猪O型口蹄疫合成肽疫苗免疫猪，重组腺病毒刺激猪产生的抗O型FMDV抗体水平更高，引起的T淋巴细胞增殖更显著，并能对猪产生完全的免疫保护。

3　展望

PPV VLPs能够很好地模拟天然PPV粒子的结构，具有与天然PPV相同的血凝活性和免疫原性。PPV VLPs还允许外源抗原基因的插入或融合，形成在表面展示外源表位的嵌合VLPs，可以实现多价或多种病毒抗原的同步免疫。VLPs还可以作为一种新型的亚单位疫苗，具有很好的构象，易被机体免疫系统识别，而且感染性遗传物质的缺失使其安全性更高。因此，基于VLPs的疫苗研究具有广阔的前景。但PPV VLPs疫苗的生产也存在一些技术难题，如常用的几种表达系统形成VLPs的效率较低，形成VLPs的各个基因表达量不易控制，大规模制备过程复杂。相信在不久的将来，随着分子生物学、系统生物学、基因工程和相关纯化技术的进步，相关的技术难题将被克服。

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收稿日期：2016-01-22

基金项目：广西科技合作与交流计划项目(桂科合14125008-2-6)；广西自然基金项目(2014GXNSFAA118120)；广西重点实验室建设项目(14-045-31-A-5)

作者简介：杜毅超(1991-)，男，甘肃灵台人，硕士研究生，主要从事动物传染病与分子免疫学研究。*通讯作者

中图分类号:S852.659.2

文献标识码:A

文章编号:1007-5038(2016)07-0071-05

Progress on Porcine Parvovirus Virus-like Particles

DU Yi-chao1,2,WU Jian-min2,LIU Jin-feng2

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,GuangxiUniversity,Nanning,Guangxi,530004,China;2.GuangxiKeyLaboratoryofAnimalEpidemicEtiologyandDiagnosis,GuangxiVeterinaryResearchInstitute,Nanning,Guangxi,530001,China)

Abstract:Porcine parvovirus(PPV) is a main pathogen that causes serious reproductive disease of swine and death of piglets,and vaccination is one of the major measures.Due to bio-safety concern,the inactivated vaccine was mainly used at home.Virus-like particles(VLPs) has the advantages of higher security and immunogenicity,it has become one of the hottest direction of virus vaccine research.Porcine parvovirus virus-like particles(PPV-VLPs) are empty capsid particles without PPV DNA,which are self-assembled by VP2 structural protein and are analogous to natural virus particles in morphology,and it has very strong bioactivity and immunogenicity.To provide the reference for the research of PPV-VLPs,this article reviewed immune mechanism of VLP-based vaccines and self-assembling of PPV-VLPs in the domestic and overseas.

Key words:Porcine parvovirus;VP2;virus-like particle