细胞存活和生长的检测方法探讨

张 哲

(牡丹江医学院医药研究中心,黑龙江 牡丹江 157011)



细胞存活和生长的检测方法探讨

张 哲

(牡丹江医学院医药研究中心,黑龙江 牡丹江 157011)

MTT是一种检测细胞存活和生长的方法。该技术现已广泛用于生物和医学等领域。基于此，针对该法进行探讨，以期与同行探讨，更好地推动生物医学的发展。

MTT法；细胞；检测

MTT是一种粉末状化学试剂，化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名为噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。其用途主要有两方面，包括药物(也包括其他处理方式如放射线照射)对体外培养细胞毒性的测定以及细胞增殖和细胞活性测定。该法在生物、医药等研究中具有重要作用[1-2]，鉴于此，以下针对该法进行深入探讨。

1 检测原理

活性细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死亡细胞则无此功能。二甲基亚砜能溶解细胞中的甲瓒，使用酶标仪在490 nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的数量值与细胞数成正比。根据测得的吸光度值，来判断活性细胞数量，吸光度值越大，表明细胞活性越强。若是测药物毒性，则表示药物毒性越小。

2 药品和仪器

MTT 配成的终质量浓度为5 mg/mL，须用PBS或生理盐水做溶剂。在配制和保存的过程中，容器应采用铝箔纸包住，确保其无菌。MTT甲瓒溶解液，二甲基亚砜和三联溶解液。酶标仪、分光光度计、倒置显微镜。

2 实验方法

2.1 细胞计数

使用胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数后调整其浓度。细胞密度在长到80%至90%，消化离心收集后，将上清液去掉，加入3 mL培养基并混匀。取另一支新的15 mL无菌离心管，装入培养基。从第一步准备的3 mL细胞悬液中取出1 mL，加入上管混匀后进行细胞计数，该浓度相当于细胞计数板4个大格内，其中每大格平均5～10个细胞；如果该浓度不够，应再根据计数的结果滴加细胞悬液，每滴按50 μL计算。细胞数量因实验目的不同应做相应调整，如一般细胞增殖实验每孔2 000个，细胞毒性实验每孔5 000～10 000个。此外，还应根据细胞本身特性，如生长快慢等因素来决定细胞数量。

2.2 96孔平底板铺细胞

制备好细胞悬液后，轻轻混匀，每孔加入100 μL，确保待测细胞的密度为5 000～10 000/孔，用无菌PBS填充边缘孔。因为细胞在混匀后仍要继续沉降，所以接种的过程中要反复多次混匀，例如每加6个孔时就应混匀一次，用以确保各孔间接种的细胞密度完全相同，进而保证MTT结果的准确性。

2.3 药物处理

在培养箱中培养已接种好的细胞培养板，在孔板底部铺满单层细胞时(96孔平底板)，加入不同浓度梯度的药物。细胞贴壁后即可加药，时间为2 h即可。

2.4 观察药效

于培养箱中5% CO2，37 ℃ 孵育16～48 h后，在倒置显微镜下观察药物的作用效果。

2.5 MTT反应

在每孔中加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL，即0.5%MTT)，继续培养4 h。如果药物与MTT能够反应，可在离心后弃去培养液，之后小心用PBS冲2至3遍后，再加入含MTT的培养液。

2.6 溶解结晶

终止培养，准备溶解结晶。溶解结晶的方法有两种，一种方法是使用二甲基亚砜溶解。在MTT加入培养4 h后，可充分形成结晶。去掉上清液，注意不能把蓝紫色结晶甲瓒移走。每孔中加入150 μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490 nm波长处检测各孔的吸光值。另一种方法是使用三联溶解液，在MTT加入培养4 h后，可充分形成结晶。直接在每孔中加入100 μL溶解液。因为该溶解液含有SDS，在低温保存时易产生结晶，所以在使用之前必须提前几小时置于室温中，待SDS结晶全部溶解后方可使用。放入培养箱中继续孵育4～6 h，于镜下观察，待结晶全部溶解后于570 nm波长处测定其吸光度值。

2.7 吸光度测定

应同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)，测定各孔吸光度值。

3 结果统计方法

采用改良寇式法计算IC50。

4 总 结

检测细胞生长、存活和增值的方法有很多种，如BrdU标记法、结晶紫法、酸性磷酸酶法等。每种方法各有其优缺点，而本研究针对MTT检测细胞存活和生长的方法进行了深入探讨。正确掌握该法并将其应用于医药研究和生物医学研究中[3-4]，可以更好地进行科学研究工作，为生物和医学等领域的发展提供可靠的基础数据。

[1]ZUPANIC A, BURMAOGLU S, ALGUL O, et al. Synthesis and anti-proliferative activity of fluoro-substituted chalcones[J]. Bioorg Med Chem Lett, 2016, 26(13):3172-3176.

[2]BORGES I P, CASTANHEIRA L E, BARBOSA B F, et al. Anti-parasitic effect on toxoplasma gondii induced by BnSP-7, a Lys49-phospholipase A2 homologue from bothrops pauloensis venom[J]. Toxicon, 2016, 1(119):84-91.

[3]SEEIL D S, DHIVYS S, SELVAMURUGAN N, et al. Guar gum succinate-sodium alginate beads as a pH-sensitive carrier for colon-specific drug delivery[J]. Int J Biol Macromol, 2016, 10(91):45-50.

[4]SADEGHI A R, NOKHASTEH S, MOLAVI A M, et al. Surface modification of electrospun PLGA scaffold with collagen for bioengineered skin substitutes[J]. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl, 2016, 1(66):130-137.

补充钙(Ca)元素的食疗方法

若缺钙，身有害，大小人，不自在。一岁儿，不能行，再发展，佝偻病，成年人，体减形，

身无力，腿软疼，逐渐变，残废人，食疗法，是先行。其一法：取石膏，加滑石，灶心土，

布包后，放水缸，或水井，水饮用，钙速增。其二法：取滑石，二十克，海螵蛸，一百克，

经炮制，研为末，米汤引，日三次，每十克，半月愈。其三法：石决明，二十克，加蛋壳，

一百克，经炮制，研为末，豆浆引，日三次，每次服，二十克，一月愈。其四法：取龙骨，

五十克，加黄豆，五百克，经炮制，研为末，日三次，骨头汤，每次服，十五克，半月愈。

其五法：海产品，各种虾，加小鱼，经炮制，研为末，或酥脆，经常吃，数日愈。还要忌，

事三件，凡属于，铅化物，氧化铅，氧化铝，氧化镉，各种类，数类药，要警惕，切勿用。

摘自《头发诊断与食物调节》

The Detection of Cell Survival and Growth

ZHANG Zhe

(Mudanjiang Medical University, Heilongjiang Mudanjiang 157011, China)

The cell survival and growth could be detected by MTT. The technology is now widely used in biological and medical fields. Based on this, this study was used to detect the efficiency of it, and further the development of biomedical science would be promoted.

MTT; cell; detection

1006-446X(2016)11-0069-03

2016-05-27

张哲(1987—)，男，助理实验师，学士，主要从事分子生物学方向研究。

Q 2.33

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