DNA指纹图谱技术及其在甘蔗育种上的应用

吴建涛，王勤南，周 峰，谢 静，许环映，常海龙(广州甘蔗糖业研究所 广东省甘蔗改良与生物炼制重点实验室，广东广州5036；农业部广东甘蔗种质资源与利用科学观测实验站，海南三亚5705)



DNA指纹图谱技术及其在甘蔗育种上的应用

吴建涛1,2，王勤南1,2，周 峰1,2，谢 静1,2，许环映1,2，常海龙1,2
(1广州甘蔗糖业研究所 广东省甘蔗改良与生物炼制重点实验室，广东广州510316；2农业部广东甘蔗种质资源与利用科学观测实验站，海南三亚572025)

摘 要：随着分子标记的不断开发和利用，DNA指纹图谱技术得到了快速发展。本文简要阐述了几种常见的构建DNA指纹图谱分子标记方法的基本原理、优缺点及其在构建不同植物DNA指纹图谱中的应用，总结了构建指纹图谱的指纹代码的5种方法和在甘蔗育种中应用，并对DNA指纹图谱在甘蔗育种应用中存在问题与展望进行了简单的讨论。

关键词：DNA指纹图谱；分子标记；甘蔗育种；应用

0 引言

DNA指纹图谱技术(DNA Fingerprinting)是1984年由英国科学家Jeffreys开发出的。近年来，随着生物技术的发展，新的分子标记不断被开发和利用，建立在分子标记技术上的DNA指纹图谱技术也得到了快速发展，利用分子标记构建的DNA指纹图谱可直接反映甘蔗的遗传物质在DNA分子水平上的差异，具有较高的多态性和个体特异性，且不受环境和生长阶段影响，能鉴定形态标记所难以鉴定的个体[1]。近年来，DNA指纹图谱技术广泛应用于作物品种间的亲缘关系分析和分子身份证绘制研究。

本文就构建DNA指纹图谱的分子标记类型、指纹代码及在甘蔗育种中的应用作简要综述，以期为DNA指纹图谱技术在甘蔗育种上的应用研究提供参考。

1 构建DNA指纹图谱的分子标记

DNA分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某些差异特征的DNA片段。目前，经过几十年的发展，现在的DNA标记技术已有几十种，主要有以下几大类：第1类以Southern杂交为基础，如限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)、原位杂交(In Situ Hybridization, ISH)；第2类以PCR技术为基础，如随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD)、任意引物PCR(Arbitrary Primer-PCR, AP-PCR)、DNA指纹技术(DNA Fingerprinting, DAF)、扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP)、相关序列扩增多态性(Sequence-Related Amplified Polymorphism, SRAP)、靶位区域扩增多态性(Target Region Amplified Polymorphism, TRAP)、插入/缺失多态性(Insertion/deletion Polymorphism, Indel或I/D)；第3类以重复序列为基础，如简单重复序列(Simple Sequence Repeat, SSR)、简单序列重复间扩增多态性(Inter-simple Sequence Repeat, ISSR)；第4类以mRNA为基础，如逆转录PCR(Reverse Transcription PCR, RT-PCR)、表达序列标签(Expressed Sequence Tag, EST)；第5类以单核苷酸多态性为基础，如单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)。

本文简要介绍用于构建DNA指纹图谱的一些分子标记，如RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISSR、SRAP和SNP等。

1.1 限制性片段长度多态性(RFLP)

RFLP是以Southern杂交为基础的第1代遗传标记，1975年由美国科学家Grodzicker等[2]创立的，其基本原理是利用特定的限制性内切酶将基因组DNA进行酶切，利用凝胶电泳分析所形成的不同的DNA片段，经转膜和Southern杂交，分析DNA多态性。RFLP标记是共显性标记，呈孟德尔遗传，不受环境条件的影响；检测可靠性高，重复性好。目前，RFLP标记已应用于家蚕[3]、细菌[4]等生物的指纹图谱构建。但是，RFLP的技术要求高，DNA需要量大，步骤较多，检测时间长，成本高，需使用放射性同位素，难以大规模推广应用。

1.2 随机扩增多态性DNA(RAPD)

RAPD是1990年由美国杜邦公司科学家Williams等[5]和加利福尼亚生物研究所Welsh等[6]发明的一种分子标记技术，它以基因组DNA为模板，以一个随机多态核苷酸序列(8～10 bp)为引物，经PCR扩增产生不同的DNA片段，通过琼脂糖或聚丙烯酰胺电泳分离检测扩增DNA多态性。RAPD技术DNA用量少，显性遗传，简单快速，引物设计随机，不使用放射性同位素，可对未知序列的基因组进行多态性分析，进而构建指纹图谱。目前，RAPD已应用于茶树[7]、鸢尾[8]等植物DNA指纹图谱构建。但是，RAPD技术稳定性差、不同物种效果不同、不能鉴定杂合子、信息量较少。

1.3 扩增片段长度多态性(AFLP)

AFLP是1993年由荷兰科学家Zabeau等[9]发明的，其基本原理是用2种限制性内切酶对基因组DNA进行酶切，然后再将特定的双链接头连接在酶切片段的两侧，形成带接头的特异性片段，以此为模板，以接头序列和相邻的限制性位点序列为基础设计引物进行扩增，扩增产物经放射性同位素标记、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后检测DNA多态性。AFLP结合了RFLP和PCR技术特点，多态性丰富，结果稳定可靠，重复性好，是典型的孟德尔遗传，所需DNA量少，可以不知基因序列的情况下进行研究，在一次单个反应能检测到大量的片段，可以分析基因组较大的作物，适合构建复杂基因组植物的指纹图谱。目前，己应用于水稻[10]、玉米[11]、棉花[12]等作物的指纹图谱构建。但是，AFLP是显性标记，只显示扩展片段的有或无，容易出现假阳性带、技术复杂、成本高。

1.4 简单重复序列(SSR)

SSR又称微卫星DNA(Microsatallite DNA)，是1982年由美国人Hamade等[13]创立的基于PCR的第2代分子标记。SSR是一种真核生物基因组中普遍存在的重复序列，一般由1～6个碱基组成，重复次数在不同物种或同一物种不同基因型之间是高度可变的，两端是保守的单拷贝序列，可用于设计特异引物扩增中间的重复序列，通过琼脂糖电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳分析DNA多态性。SSR具有RFLP的优点且不需要使用放射性同位素，同时比RAPD重复性和稳定性高。SSR标记数量丰富，多态性高，呈共显性，可鉴别杂合子和纯合子，所需DNA量少，在构建DNA指纹图谱方面显示了独特的优越性。国际植物新品种权保护联盟(UPOV)在BMT分子测试指南中，已将构建DNA指纹数据库的标记方法确定为SSR和SNP[14]，其中SSR标记因其技术比较成熟，成为当前各个作物建库的首选标记。不同研究者利用SSR标记构建了水稻[15]、玉米[16]、柑橘[17]等作物的指纹图谱。然而，SSR技术必须知道重复序列两端的单拷贝序列才能设计特异引物用于扩展检测，因此其开发费用较高。

1.5 简单序列重复间扩增多态性(ISSR)

ISSR是在SSR基础上发展的一种新型分子标记，1994年由加拿大蒙特利尔大学的Zietkiewicz 等[18]提出。ISSR标记以基因组中SSR本身为引物，在SSR序列的3’或5’端加锚2～4个随机核苷酸，利用锚定引物进行PCR扩增，通过琼脂糖电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳分离DNA片段。ISSR结合了RAPD和SSR的优点，成本低，DNA用量少；试验操作简单、快速、高效；遗传多态性高，重复性好；显性标记，呈孟德尔式遗传；不需要知道任何靶标序列的SSR背景信息。目前，利用ISSR构建了水稻[19]、玉米[20]、小菊[21]等作物指纹图谱。但是它与RAPD相似，不能区分显性纯合基因型和杂合基因型。

1.6 相关序列扩增多态性(SRAP)

SRAP是2001年由美国加州大学科学家Li等[22]开发的，其基本原理是根据基因外显子GC含量丰富而启动子和内含子AT含量丰富的特点设计引物，对基因组开放阅读框(Open Reading Frames, ORFs)进行扩增，上下游引物分别对外显子区域和内含子、启动子区域进行特异扩增，因不同个体或物种的内含子、启动子与间隔区长度不同产生多态性。SRAP分布均匀，多态性强，DNA需要量少，共显性，简单且花费少。目前已成功地应用于多种作物的指纹图谱构建，如国兰[23]、南瓜[24]等。但是，SRAP是对ORFs进行扩增，对着丝粒附近以及端粒的扩增会较少。同时，没有利用扩增区域序列的任何信息，产生的分子标记是随机地分布在染色体上的。

1.7 单核苷酸多态性(SNP)

1996年，美国学者Lander[25]提出SNP为新一代分子标记，SNP是指基因组单个核苷酸(A，T，C，G)的置换或颠换所引起的DNA序列多态性，通常所说的SNP不包括碱基的插入、缺失以及重复序列拷贝数的变化[26]。SNP是继RFLP和SSR之后发展起来的第3代标记技术，具有以下优点：数量多，分布广泛；遗传稳定性高；二态性，非此即彼，易于快速且高通量地进行基因型分型。SNP是国际植物新品种权保护联盟(UPOV)BMT分子测试指南中构建DNA指纹数据库的推荐标记之一。SNP已在油菜[27]、甜菜[28]等作物指纹图谱构建中使用。利用DNA芯片技术是检测SNP的最佳方法，随着DNA芯片技术的发展，SNP有望成为最重要最有效的分子标记技术。但是，制作SNP图谱要求个体多，成本高；功能难以确定；涉及专利问题。

2 构建指纹图谱的指纹代码方法

2.1 标记扩增图谱中位点条带直接转化为“0, 1”数字串指纹

该方法是根据每个品种DNA扩增图谱中标记位点条带的有无或缺失用0和1进行数字化统计，结果为由0和1排列形成的字符串，构成一个品种的数字指纹图谱。如缪恒彬等[21]采用此方法构建了25个小菊品种的ISSR指纹图谱，张婉等[29]利用该方法构建了70个白菜品种的SSR指纹图谱数据库。该方法较为简单，但数据统计工作量较大，并且对不同大小条带的统计存在误差，对未知样品进行鉴定时需要逐一对比“0, 1”数字串，比较麻烦。

2.2 标记扩增特征带、特异谱带类型和多引物组合，共同组成“0, 1”数字串指纹

该方法是统计的谱带结果，筛选具有特征带的特异标记和扩增产物多态性好、产生丰富的谱带类型，然后再利用不同的引物扩增产生的谱带组合，确定核心引物，将核心引物的特征谱带转化为“0, 1”数字串指纹。如李雪莲等[30]应用该法构建了23个两用桃品种(系)的指纹图谱；匡猛等[31]采用该方法构建了32份棉花主栽品种的指纹图谱。该方法构建图谱、鉴定未知样品均较简单，但其需要较多的引物才能取得足够的特异位点，试验成本高，工作量大。

2.3 十进制数字串条形码

该方法根据电泳结果采用“0, 1”系统记录谱带位置，将每对引物在品种间扩增得到“0, 1”(二进制)数据转化成十进制数据，该十进制数据代表每个引物扩增的结果，核心引物组合的十进制数字串作为每一个品种的数字指纹。如聂新辉等[32]利用该方法构建了51个新陆早系列常规棉花新品种的DNA指纹图谱；潘兆娥等[33]采用此法构建了中棉所48的数字指纹图谱。该方法实际上是本文2.1小节所述方法的改进，方便数据观察和比对，但统计条带时较为麻烦。

2.4 标记字母编号和分子量相结合编码

该方法首先统计每份材料引物扩增条带分子量大小，再将引物进行编号，如果一份材料经同一引物扩增同时出现多条条带，则用“-”连接，无条带则为0，每个材料的DNA经不同的引物扩增后会形成由字母和数字组成的一系列带型编号，便形成了该材料的指纹图谱代码。如宋海斌等[34]应用该方法构建了105份甜瓜品种(系)的指纹图谱库；王静毅等[35]采用该法绘制了56份香蕉种质的指纹图谱。该方法也是对本文2.1小节所述方法的改进，方便记录和数据参考利用，但仍需繁琐的统计条带。

2.5 指纹图谱分析软件自动编码

该方法是首先将实验中获得的电泳图转化为由“0, 1”描述的数据，构建二元数据矩阵，然后导入DNA指纹图谱分析软件进行多态性与特异性分析，获得个体的指纹图谱。刘娟等[36]应用该方法构建了48个新疆杏品种(系)指纹图谱；徐宗大等[37]利用该方法构建了50个玫瑰种质的分子指纹图谱。该方法分析快速准确，减少了指纹图谱绘制时间，降低了人工观察可能产生的误差，但需要开发软件。

3 DNA指纹图谱在甘蔗育种中的应用

3.1 甘蔗品种鉴定和真实性检测

目前，在中国种植的主要甘蔗栽培品种遗传胞质基本来自“甘蔗高贵化育种”过程的后代，品种间生物学特性差异较小。再加上骨干亲本的重复使用，新基因资源的缺乏，甘蔗品种间的遗传差异越来越小，使得单纯依据形态性状进行品种田间检验越来越困难。利用分子标记构建甘蔗DNA指纹图谱为甘蔗品种鉴定和真实性检测提供了一种有效的手段，不少学者利用分子标记构建指纹图谱对甘蔗品种进行了鉴定，Piperidis等[38]利用SSR标记构建了180个甘蔗品种的指纹图谱库并应用于品种鉴定；Da Silva[39]等利用SSR标记构建指纹图谱对3个甘蔗品种(系)进行了鉴定；刘新龙等[40]从120对SSR标记中筛选出8对核心引物，构建了27份云南自育品种DNA指纹图谱，并用10个甘蔗主栽品种对3个高效引物组合进行验证。

3.2 甘蔗品种亲缘关系和分类研究

现代栽培甘蔗品种是遗传背景非常复杂的多倍体或非整倍体，均由种间杂交育成。甘蔗亲本系谱在一定程度上能反映品种之间的亲缘关系，是杂交组合选配的重要依据之一，但由于自交、串粉等因素，存在一定的局限性。基于分子水平的亲缘关系较基于系谱的亲缘关系具有更高的可靠性[41-42]。根据品种间DNA指纹图谱的差异程度可判断品种间亲缘关系的远近和测量品种间遗传距离，进行系谱分析，并可据此进行分类研究。一些研究人员利用甘蔗DNA指纹图谱对甘蔗种质进行了亲缘关系和分类研究，庄南生等[43]采用AFLP构建了54份种质(14份祖亲种、40份栽培品种或品系)的指纹图谱，并分析了不同种质的相似系数和亲缘关系，探讨了甘蔗种质系谱与聚类分析的关系以及斑茅种的分类地位问题；王英等[44]采用ISSR分子标记技术构建了96份甘蔗种质(39份祖亲种、57份栽培品种或品系)的ISSR指纹图谱，以及不同种质的亲缘关系；Pan等[45]利用21个SSR标记对116个甘蔗品种进行了遗传多样性分析和亲缘关系分析；郑益凤[41]利用SSR荧光标记构建了116个甘蔗常用亲本、创新亲本或新亲本的DNA指纹图谱，并对这些种质材料进行了聚类分析、主成分分析和遗传相似性分析，获得了这些甘蔗亲本的遗传多样性信息；王英等[46]采用RAMP分子标记技术对80份甘蔗种质(32份祖亲种、48份栽培品种或品系)的遗传基础进行了分析，构建了甘蔗80份种质的RAMP指纹图谱，并分析了不同种质的遗传关系，同时在栽培种中检测到部分热带种、野生种及斑茅种特异片段，初步证明了外源基因已导入甘蔗栽培种中；姚春雪等[47]利用SSR技术构建了67份甘蔗与蔗茅杂交不同世代的指纹图谱，讨论了品种之间同源关系与聚类分析；昝逢刚等[48]利用AFLP技术分析了98份甘蔗种质遗传多样性及亲缘关系。

4 存在问题及展望

DNA指纹图谱技术在作物品种资源中己得到广泛地应用，但甘蔗基因组庞大，结构复杂，甘蔗分子育种研究进展较为缓慢[49]，阻碍了DNA指纹图谱在甘蔗种质资源中的应用。随着DNA标记技术的发展，甘蔗种质遗传多样性分析、DNA指纹图谱构建、分子标记鉴定品种等也会得到快速发展。目前，大多数DNA指纹图谱检测技术仍比较烦琐，限制了该技术在育种中的大规模应用。随着分子生物学新仪器的研制和生物信息学的应用，一些研究单位研发了自动化程度的检测仪器，开发了指纹图谱分析软件，从加样到数据分析全过程实现人工智能控制，大大提高了DNA指纹图谱检测的效率与准确性[1]。

甘蔗是我国主要的糖料作物，甘蔗蔗糖产量约占中国食糖总量的92%，我国甘蔗品种遗传基础极为狭窄，严重制约甘蔗产业的进一步发展[50]。同时，中国在甘蔗品种资源生产和经营方面尚不规范，品种引种混乱或品种造假的现象时有发生。构建甘蔗品种DNA指纹图谱能够准确和全面地了解中国甘蔗品种的遗传多样性，为针对性地开展亲本引进、创新和配置杂交组合提供重要参考，促进甘蔗育种发展；通过构建中国甘蔗品种身份证，为种质资源的保护、完善系谱、品种鉴定提供支撑。

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(本篇责任编校：李金玉)

DNA Fingerprinting Technology and Its Application in Sugarcane Breeding

WU Jian-tao1,2, WANG Qin-nan1,2, ZHOU Feng1,2, XIE Jing1,2, XU Huan-yin1,2, CHANG Hai-long1,2
(1Guangzhou Sugarcane Industry Research Institute/Guangdong Key Lab of Sugarcane Improvement & Biorefinery, Guangzhou 510316;2Scientific Observation Test Station of Sugarcane Germplasm Resources and Utilization, Ministry of Agriculture, Sanya, Hainan 572025)

Abstract:DNA fingerprinting technologies have been rapidly developed with the development and utilization of kinds of new DNA molecular markers recently. This paper briefly reviewed the basic principle, advantages and disadvantages, application of several molecular markers in constructing DNA fingerprinting. Five methods to build fingerprint code and their application in sugarcane breeding were summarized. In addition, the problems existing in the application of DNA fingerprinting technology and outlook were also briefly discussed.

Keywords:DNA fingerprinting; Molecular marker; Sugarcane breeding; Application

作者简介：吴建涛(1983-)，男，农艺师；E-mail：wujiantao2010@163.com

基金项目：现代农业产业技术体系建设专项资金(CARS-20-1-6)；广东省科技计划项目(2015A030303005､2014A030304026､2013B020311002､2013B060400027和粤科财字[2013]82号)；广州市科技计划项目(2014J4100227)

收稿日期：2015-12-26；修回日期：2016-02-02

中图分类号：S566.1

文献标识码：A

文章编号：1005-9695(2016)01-0001-06

引文格式：吴建涛，王勤南，周峰，等. DNA指纹图谱技术及其在甘蔗育种上的应用[J]. 甘蔗糖业，2016(1)：1-6.