革兰阴性杆菌对碳青霉烯类药物耐药机制研究进展

杨 刚 综述,尹 宁 审校

(新疆医科大学第六附属医院，新疆乌鲁木齐 830002)



·综 述·

革兰阴性杆菌对碳青霉烯类药物耐药机制研究进展

杨 刚 综述,尹 宁△审校

(新疆医科大学第六附属医院，新疆乌鲁木齐 830002)

革兰氏阴性菌； 抗菌药; 药物耐受性; 碳青霉烯类

革兰阴性杆菌是感染性疾病特别是住院患者医院感染的主要病原菌，临床分离的致病性多重耐药的革兰阴性杆菌中大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌占据前几位。随着临床抗生素的滥用，该类细菌不仅对常用抗生素耐药，而且对碳青霉烯类药物的耐药率也逐年上升。现将耐碳青霉烯类药物耐药机制研究进展综述如下。

1 碳青霉烯酶对碳青霉烯类抗生素的耐药机制

碳青霉烯酶是指能明显水解亚胺培南或美罗培南的一类β-内酰胺酶，是β-内酰胺酶家族中最多变的成员，但碳青霉烯类药物并非其唯一水解底物。碳青霉烯酶根据活性部位水解机制分为两种主要的分子家族：一种来源于革兰阳性杆菌，可被乙二胺四乙酸(EDTA)抑制，称为金属酶(MBLs)，其活性部位含有Zn2+有助于水解β-内酰胺的双环；另一种最初发现于肠杆菌科细菌，其活性部位含有丝氨酸，该类碳青霉烯酶能被克拉维酸和他唑巴坦抑制，但不能被EDTA抑制。按照分子类型可将碳青霉烯酶分为Ambler A、B、D类[1]，A、D类活性中心有丝氨酸，又称为丝氨酸酶，属于Bush分群中的第2f、2d亚组。B类活性中心含有Zn2+，称为MBLs。属于Bush分群中的第3组，可由染色体、质粒或转座子介导。

1.1 A类碳青霉烯酶 最主要的A 类丝氨酸碳青霉烯酶有3个家族即SME(serratia marcescens enzyme)、KPC(klebsiella pneumoniae carbapenemases)和NMC(non-metallo carbapenemases)/IMI(imipenemas)，均由染色体编码，其水解机制是在活性中心70号位含有丝氨酸。SME家族包括 SME-1、SME-2、SME-3。SME-1是在1982年发现于英格兰的2株黏质沙雷菌。NMC、IMI酶有97%氨基酸是相同的，其均含有相同的活性部位保守序列S-X-X-K、S-D-N和K-T-G，且在其氨基酸残基的69、238号位形成二硫键。这种二硫键普遍存在于A类碳青霉烯酶，不仅对其水解活性十分必要，而且能够稳定酶的结构[2]。在NMC-A、IMI-1和 SME-1基因编码区的上游存在与LysR家族有关的DNA结合转录调控基因，当删除nmcR调控基因时就可消除NMC-A的诱导表达并可降低碳青霉烯类药物对其的最低抑菌浓度(MIC)。

KPC、GES(guiana extended-spectrum β-lactamase)均由质粒编码，KPC-1于1996年发现于北卡罗来纳，2003年在美国东海岸发现了KPC-1的变体KPC-2，其由单个氨基酸突变所致，随后KPC在苏格兰、哥伦比亚、以色列[3]、中国等国家均有报道。KPC含有活性部位保守序列S-X-X-K、S-D-N和K-T-G。有研究显示，对碳青霉烯类药物敏感率下降的肺炎克雷伯菌均产KPC-2，KPC基因位于可移动的质粒上，可以通过质粒、整合子、插人序列的基因元件进行水平传播，造成暴发流行。有研究发现，blaOXA(编码OXA的基因)基因位于耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌质粒上，较位于染色体上更容易发生播散。GES/IBC(integron-borne cephalosporinase)家族并不常见，IBC-1在2000年发现于希腊，GES-1则分离于法属圭亚那的1株肺炎克雷伯菌，该2种酶在活性序列的69、38号位含有半胱氨酸残基。编码GES家族的基因位于质粒的整合子上，该类酶具有很广的水解谱，目前该家族成员众多，GES-2、GES-3、GES-4、GES-5、GES-6、GES-7、GES-8、GES-9相继被鉴定出来。

1.2 B类碳青霉烯酶 B类碳青霉烯酶因活性中心含有Zn2+，也称为MBLs。MBLs首先在铜绿假单胞菌、不动杆菌中被发现。近年来在肠杆菌科细菌如大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌中也有发现。MBLs编码的耐药基因位于细菌染色体、质粒或转座子上。并以基因盒的形式存在于整合子中。整合子属于可移动基因元件。可借助整合子的移动、基因盒的插入、切除而导致细菌间耐药性呈水平传播[4]，MBLs有较强的水解碳青霉烯类药物的能力且对常见的β-内酰胺酶抑制剂有抵抗作用。常见的MBLs有VIM(verona integron-encoded metallo-β-lactamase)、IMP(imipenemase)、GIM(german imipenemase)和SIM(seoul imipenemase)，其位于各种整合子结构上，当这些整合子与质粒或转座子结合时就会介导在各细菌间传播。第1例可转移性MBLs基因于1990年发现于日本的1株铜绿假单胞菌，随后各种获得性或转移性MBLs基因相继被发现[5]。IMP-1能水解亚胺培南、青霉素和广谱头孢菌素，但不能水解氨曲南，最早分离于日本的沙雷菌和其他肠杆菌科，在意大利则在鲍曼不动杆菌发现与IMP-1相似的IMP-2[6]，随后IMP家族成员在世界各地被陆续发现。目前IMP已多达34种。Ⅰ类整合子是耐药基因DNA的结构基础，还可整合其他耐药基因如氯霉素、氨基糖苷类基因，但其自身不能传播而是通过识别内部转座子结构来传播。VIM家族的编码基因位于染色体的Ⅰ类整合子上，1997年VIM-1在意大利维罗纳被发现，随后其变体VIM-2在法国被发现，二者均分离自铜绿假单胞菌。虽然二者氨基酸序列同源性很高(90%)，但结构明显不同，这也导致了其酶促动力学的显著差异。目前VIM家族种类多达15种，其耐药基因位于相应的Ⅰ类整合子内[7]。其他MBLs还有SPM(sao paulo metallo-β-lactamase)、GIM和SIM，其只在所发现国家局部传播并未造成世界范围的流行。这有别于VIM和IMP。SPM-1分离自圣保罗的铜绿假单胞菌，含有该酶的铜绿假单胞菌所致的感染有较高的致死率，其与IMP-1有35.5%氨基酸是相同的，能被EDTA、吡啶二羧酸、二氮杂菲抑制，能水解大多数广谱抗生素，主要在拉美国家流行。通过对SPM-1的编码基因区域分析显示，该区域不是整合子的一部分，而是含有一种新型的转座子结构和启动子序列[8]。近年来新型MBLs被发现如TMB-1(tripoli metallo-blactamase)，该酶来自于利比亚的1株木糖氧化无色杆菌。TMB-1与DIM-1、GIM-1同源性分别为62%、51%，blaTMB-1位于染色体上并可嵌入到Ⅰ类整合子中。2011年在日本发现了blaTMB-1 的变体blaTMB-2，多利培南和美罗培南对产TMB-2转化株的MIC较TMB-1转化株分别高256、16倍，有更强的耐药性[9]。

1.3 D类碳青霉烯酶 D类酶也称为OXA酶(oxacillin-hydrolyzing)，主要存在于肠杆菌科和铜绿假单胞菌属，由质粒编码。该类酶很少能被克拉维酸和EDTA抑制。由于其氨基酸序列存在大量可变性，导致有很多变体，目前已知有232种变体[10]。绝大多数OXA酶发现于不动杆菌属，根据氨基酸同源性将其分为9个亚组。通过对OXA酶分子结构的研究发现，催化丝氨酸残基位于70～73号位的S-T-F-K序列，而A、D类酶的丝氨酸和赖氨酸均位于此。其水解机制与其他丝氨酸碳青霉烯酶相同，底物和酶结合，在催化丝氨酸部位形成共价酰基，随后通过脱酰基作用在β内酰胺环的C-N结合处而水解抗生素使其失活。某些D类酶需要一定浓度的CO2，因为CO2可影响Lys70的羧化作用。2003年在土耳其1株肺炎克雷伯菌中分离的OXA-48对亚胺培南的水解效率较分离于不动杆菌属的OXA酶高9倍，对其分子动力学及晶体结构研究发现，其水解作用依赖于碳青霉烯类药物的α-羟乙基的旋转，在活性部位脱去酰基并以此酰化氨基酸残基[11]。编码OXA-48基因blaOXA-48(编码OXA-48的基因)通过可转移的质粒在各菌种间传播[12]。鲍曼不动杆菌中的OXA-23、OXA-58通过将OXA质粒介导入易感碳青霉烯类药物中而具有耐药作用[13]。

2 外排泵系统耐药机制

细菌外排系统是一种非特异性耐药机制，是通过细菌外排泵将进入菌体内的药物或其他底物排出膜外，已在不同细菌上发现几十种外排泵，依据氨基酸序列的同源性，将与抗菌药物相关的膜外排泵分子分为5个主要超家族[14]，包括主要易化子超家族(Mrs)、ATP结合盒(ABC)超家族、耐药节结化细胞分化(RND)超家族、小多重耐药性(SMR)家族，多药和有毒化合物排出(MATE)家族。其中RND超家族在革兰阴性杆菌耐药中发挥重要作用如大肠埃希菌中的AcrAB-TolC系统和铜绿假单胞菌中的MexAB-OprM系统。

2.1 鲍曼不动杆菌的外排系统 AdeABC外排系统是鲍曼不动杆菌中认识最早的外排系统。国外有极少数研究提示，AdeABC外排系统的过度表达可引起菌株对碳青霉烯类抗生素如亚胺培南和美罗培南的高水平耐药。AdeABC外排泵系统属于RND超家族，AdeB为内膜转运体，AdeC为外膜蛋白(OMP)，AdeA为膜融合蛋白(MFP)，其共同组成三聚体结构，形成一连续通道跨在外膜和周质之间[15]。有文献报道，AdeC对耐药无本质意义，并非必需。AdeAB共同转录并可利用另一外膜蛋白质来形成外排泵通道。AdeFGH外排泵是近年新发现的由AdeF、AdeG、AdeH共同转录编码一个RND超家族的外排系统[16]，表现出对氟喹诺酮类、四环素、氯霉素、甲氧苄啶、磺胺甲基异恶唑、十二烷基硫酸钠(SDS)和某些染料外排的增强。有研究显示，AdeFGH外排系统在鲍曼不动杆菌的亚胺培南耐药中发挥作用。

2.2 大肠埃希菌的外排系统 AcrAB-TolC系统是大肠埃希菌产生多药耐药性最重要的系统之一，属于质子依赖型，能同时产生针对有机溶剂、染料、去污剂及多种抗菌药物(如氯霉素、红霉素、四环素等)的高水平的多重耐药。AcrAB-TolC系统主要由3个部分组成，即膜融合蛋白(AcrA)、外排转运蛋白(AcrB)和外膜通道蛋白(TolC)。这些组分及其类似物是大多数革兰阴性菌产生对多种抗菌药物、染料和去污剂等多重耐药的主要机制。AcrB主要的功能域为三聚体，且包含1个大的细胞周质域为典型特征[17]，细胞周质域的每个亚基的构象有细微的差别，均具有1个底物识别位点，但在特定的时间只有1个位点(binding site)被底物所占据，排出位点紧邻周质但开放于TolC对接域，将底物推入TolC外排；接入位点(access site)紧邻TolC但开放于周质，准备接受底物。该3个周质域的构象由上述3个位点轮流替换，形成1个类似蠕动泵的机制将底物排出细胞外。AcrA蛋白的作用主要是促进外排体系与细胞膜的融合。AcrB 能识别外排药物并通过构象改变形成质子和药物分子逆向转运的能量转化体[18]。AcrAB的表达受多种调控因子的调节，分为全局和局部2个调控层次。

2.3 铜绿假单胞菌的外排系统 铜绿假单胞菌中的外排泵主要有 MexAB-OprM、MexCD-OprJ、exEF-OprN和MexXY-OprM，每一种外排泵都包括3个部分：(1)内膜蛋白如 MexB、MexY，其嵌在细菌细胞内膜，可识别抗菌药物并将其主动转运出去；(2)OMP如OprM、OprN，二者均位于细胞外膜具有孔蛋白的作用，可将抗菌药物排出菌体外；(3)膜融合蛋白如MexA、MexX等，位于内、外膜之间，可连接内、外膜。3种蛋白相互连接横贯整个细胞膜并开口于外膜，将抗菌药物排出菌体[19]。

3 与膜孔蛋白有关的耐药机制

革兰阴性菌被一层具有通透性的外膜包绕，约60%表面覆盖膜孔蛋白，其聚合起来形成孔道。大多数抗生素发挥活性的决定性因素并不单纯取决于外膜的通透性或抗生素的失活，而是取决于二者之间的平衡，外膜通透下降可以放大酶失活造成的抗生素耐药效应。

膜孔蛋白是OMP中的一类，大肠埃希菌的膜孔蛋白主要有5种：OmpF、OmpC、PhoE、LamB和蛋白K。大多数β-内酰胺类抗生素可通过的膜孔蛋白主要为OmpF、OmpC，而OmpF的通透性较OmpC高10倍。膜孔蛋白的变异可引起细菌对抗生素敏感率下降。肺炎克雷伯菌的膜孔蛋白有OmpK35、OmpK36和OmpK37，OmpK35、OmpK36相当于大肠杆菌中的OmpF、OmpC。OmpK37一般情况下不表达或表达量极少。OmpK35是细菌发生耐药最主要的膜孔蛋白。Yang等[20]研究发现，膜孔蛋白缺失这一单独因素并不能引起对亚胺培南的耐药。对大肠埃希菌来说OMP缺失合并CMY-4、CMY-2、CTX-M-2等可造成其对碳青霉烯类药物耐药[21]。

外膜孔蛋白D2(OprD2)是亚胺培南通过铜绿假单胞菌的特异性孔道，编码OprD2的结构基因位于染色体上，突变可使OprD2蛋白表达减少甚至缺失，从而导致菌体外膜通透性改变使得碳青霉烯类药物进入菌体受阻，产生耐药性。此外OprD2还能形成碳青霉烯类药物特异性结合位点，是目前所知的铜绿假单胞菌中唯一有助于抗菌药物通过的孔道蛋白[22]。OprD2缺失引起亚胺培南耐药，而将克隆有OprD2基因的质粒转导入OprD2缺失的亚胺培南耐药株中可使其恢复对亚胺培南的耐药性并在细胞膜上表达OprD蛋白[23]。在铜绿假单胞菌中存在大、小2种孔道蛋白，而大孔通道数量较少或仅有小孔通道，导致铜绿假单胞菌外膜通透性降低，产生耐药性[24]。

4 与青霉素结合蛋白(PBPs)有关的耐药机制

PBPs是一组位于细菌细胞内膜上的具有催化作用的酶，在细菌的细胞壁合成中起关键作用。在PBPs中大分子PBP1a、PBP1b、PBP2、PBP3为β-内酰胺类药物作用靶位。当β-内酰胺类药物与这些靶位结合后可使转肽酶、转糖苷酶的活性丢失，细菌的细胞壁不能合成，细菌死亡[25]。可见当PBPs基因发生变异导致蛋白改变，β-内酰胺类抗生素无法与之结合或结合能力降低均可能导致耐药。铜绿假单胞菌中有8种不同PBPs，其中PBP2、PBP3与碳青霉烯类抗生素耐药性有关，是细菌保持正常形态及生存繁殖必需的[26]。Farra等[27]研究结果显示临床分离的对亚胺培南耐药的铜绿假单胞菌耐药性与PBP位点改变密切相关。另一方面PBPs可参与头孢菌素酶(AmpC酶)表达从而产生耐药性，这些PBPs均是非必需PBP如在大肠埃希菌中PBP4过表达导致AmpC酶高产，而PBP4失活使其对AmpC酶诱导能力减弱，PBP4有诱导AmpC酶产生的作用[28]。

5 其 他

细菌对碳青霉烯类药物耐药往往是多种机制共同发挥作用。通过对1株耐碳青霉烯类药物的大肠埃希菌研究显示，其缺少OmpF、OmpC，并携带有耐药基因marR和功能性非翻译基因yedS[29]。其所表达的蛋白marR和yedS被认为可耐碳青霉烯类药物。在大肠埃希菌中操纵子marRAB能编码marR、marA和marB。而marA过度表达可正向调节外排泵AcrAB-TolC，使之表达增加，外排作用增强；另一方面marA可通过MicF这种小RNA来抑制OmpF，使其对碳青霉烯类药物耐药。

6 结 语

革兰阴性杆菌耐碳青霉烯类药物的耐药机制是复杂的，往往多种机制共同发挥作用。革兰阴性杆菌种类繁多，有些耐药基因可通过质粒在各细菌间相互传播，导致新的变体的出现。另一方面抗生素的滥用也会使细菌产生新的耐药基因，造成耐药率不断升高。有些细菌自身外排泵高表达，孔道蛋白的改变也会对碳青霉烯酶类药物耐药。因此，在临床要加强对该类细菌的监测，根据细菌药物敏感试验结果合理使用抗生素。

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新疆医科大学科研创新基金资助项目(XJC2012142)。 作者简介：杨刚，男，在读硕士研究生，主要从事病原微生物学的研究。△

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10.3969/j.issn.1673-4130.2016.02.034

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2015-07-30)