卵母细胞玻璃化冻融获成功妊娠1例

唐永梅 韦立红

(广西柳州市妇幼保健院生殖助孕中心，柳州市 545001，E-mail：TYMei75@126.com)

卵母细胞玻璃化冻融获成功妊娠1例

唐永梅 韦立红

(广西柳州市妇幼保健院生殖助孕中心，柳州市 545001，E-mail：TYMei75@126.com)

目的 探讨玻璃化冷冻方法在冷冻保存卵母细胞中的临床应用价值。方法 2015年3月在我中心行卵母细胞玻璃化冷冻1例,于2015年7月行玻璃化解冻，行卵胞浆内单精子注射受精，获得胚胎后进行移植和冷冻。结果 共冷冻13枚卵母细胞，解冻后存活12枚(92.3%)，对12枚成熟卵母细胞行单精子卵浆内显微注射，9枚(75.0%)正常受精，8枚(88.9%)卵裂，再次解冻移植获单胎妊娠，现正在妊娠中。结论 玻璃化冻融卵母细胞是一种方便可行的方法,在特殊情况下发挥着不可替代的作用，可以获得临床妊娠。

体外受精胚胎移植；卵母细胞；玻璃化冷冻

卵母细胞是人类最大的单细胞，对外部环境非常敏感。卵母细胞在冷冻过程中很少能完好无损。因为减数分裂的纺锤体对温度敏感且冷冻后透明带变硬，所以通常采用卵胞浆内单精子显微注射解决卵子受精。玻璃化冷冻技术可以解决卵子低存活率问题，使冷冻卵母细胞的效率大大提高。现报道我中心采用玻璃化冷冻技术冷冻的1例成功案例。

1 病例摘要

樊某，36岁，因输卵管因素，原发不孕6年于2015年3月在我中心行体外受精胚胎移植术治疗。患者基础激素：孕酮(progesterone，P)0.51 ng/ml，雄性激素(testosterone，T)68.82 ng/dl，雌二醇(estradiol，E2)101.31 pg/ml，垂体泌乳素(prolactin，PRL)6.89 ng/ml，促卵泡生成激素(follicle-stimulating hormone，FSH)7.89 MIU/ml，促黄体素(luteotropic hormone，LH)5.52 MIU/ml，基础窦卵泡14个，采用注射用醋酸曲普瑞林(达菲林，益普生制药有限公司)1.2 mg长方案降调节22 d后给予人促性腺激素(Gn)150 IU/d，连用12 d。当卵泡直径大于18 mm的卵泡数为8个，占发育卵泡60%时，注射重组人绒促性素(艾泽，默克雪兰诺公司)250 μg 36 h后，阴道B超引导下穿刺取卵，穿刺18个卵泡获得17个卵子。由于取卵日患者丈夫因车祸在治疗中不能来院取精，患者要求冷冻卵母细胞并签署知情同意书。故在取卵后2 h给予透明质酸酶80 IU消化20～30 s后脱颗粒细胞，在倒置显微镜下观察有13个成熟卵(MⅡ期)，4个未成熟卵(GV期)。对13个MⅡ期卵行玻璃化冷冻，1～2个/管共7管，冷冻试剂盒采用Irvine公司通用玻璃化冷冻试剂盒。2015年7月，夫妇俩来院申请解冻卵母细胞后行体外受精胚胎移植术治疗。女方采用促排卵周期准备内膜，注射人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG)5 000 IU 36 h后解冻卵母细胞，解冻13个卵母细胞，存活12个，同时嘱男方取精，处理后行卵胞浆内单精子显微注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)后正常受精9个，卵裂8个，可利用胚胎6个，其中优胚4个。于受精后72 h(D3)移植2枚胚胎，冷冻4枚。移植日内膜厚度12 mm，移植后肌注黄体酮60 mg/d，14 d后检测血HCG阴性，未妊娠。2015年8月患者再次来院申请解冻移植，采用自然周期准备内膜，移植日内膜厚度11 mm，解冻移植2枚优胚后常规肌注黄体酮60 mg/d，14 d后血HCG阳性，35 d后 B超显示宫内单胎妊娠，至2015年11月继续妊娠中。

2 讨 论

1986年Chen等[1]应用程序冷冻技术成功冷冻、复苏了人卵母细胞并获婴儿出生，但采用传统冷冻保护剂PROH和蔗糖的程序冷冻技术的复苏存活率和受精率低。1999年Kuleshova等[2]应用玻璃化冷冻法成功冷冻、复苏卵母细胞并获分娩以后，玻璃化冷冻卵母细胞的效率大大提高。卵母细胞体积大(80～130 μm)，在冷冻过程中渗透性冷冻保护剂进入细胞膜和水分渗透出细胞膜的速度均明显较慢，容易形成细胞内冰晶，另外卵母细胞的一些特殊结构微管、微丝、纺锤体也易受冷冻的影响，冷冻损伤卵母细胞的骨架，尤其是纺锤体结构进而影响卵母细胞的生理功能，影响复苏存活率和胚胎发育[3]。目前传统的程序冷冻技术逐渐被玻璃化冷冻技术替代。玻璃化冷冻采用高浓度的低温保护剂，高渗透性抗冻剂在短时间内达到细胞内、外的浓度平衡，将细胞内大部分水置换，并与剩余水分形成氢键，降低冻结部分电解质浓度，使细胞减轻盐害及溶液效应；同时也改变了胞内过冷状态，使细胞内压接近细胞外压，降低了细胞脱水皱缩程度和速度，减小了细胞的损伤，成为目前卵子冷冻方法的主流。

国际上卵母细胞冷冻技术主要用于女性生育力的保存，如有生育要求的未婚女妇女或肿瘤患者在放疗和化疗前进行卵母细胞的冷冻保存。在我国该技术未被广泛应用，目前主要用于供卵周期或取卵日男方取不出精子时[4-6]。当然睾丸取精是预测和干预取卵日取精失败的保障，可以避免卵母细胞的冷冻[7]。笔者对于本例患者获得成功的体会有以下几点：(1)使用适合的玻璃化试剂盒，并严格按操作说明操作，卵子冷冻可以得到较好的复苏效果。(2)采用Cryotop冷冻载杆，冷冻时减少保护液量，同时每支载杆最多装载2个卵子，使细胞迅速度过冷冻解冻的温度危险区。(3)卵子的冷冻时机很重要，尽可能在取卵后3 h内冷冻，否则卵子老化影响ICSI授精后的卵裂速度。 虽然有报道认为冷冻GV期比MⅡ期的解冻存活率更高[8]，但GV期复苏行体外成熟再ICSI受精后的发育潜力较低，故本例未冷冻GV期卵母细胞，但随着研究技术的发展，冷冻GV期卵母细胞将会得到更好的应用。

卵母细胞冷冻保存作为生育力保存的重要组成部分，在特殊情况下发挥着不可替代的作用。作为取卵日男方取精失败的措施，卵子玻璃化冷冻是减少患者相关损失的最后保障。目前对卵母细胞安全性仍有待研究[9-10]。随着玻璃化冷冻技术的不断发展和国家法律法规的不断完善，该技术将可广泛应用于临床。

[1] Chen C.Pregenancy after human oocyte cryopreservation[J].Lancet,1986,1(8 486):884-886.

[2] Kuleshova L,Gianaroli L,Magli C,et al.Birth following vitrification of a small number of human oocytes:case report[J].Hum Reprod,1999,14(12):3 077-3 079.

[3] 李 媛.人类辅助生殖实验技术[M].北京:科学出版社,2008:170-172.

[4] 王 媁,严正杰,蔡令波,等.卵子冷冻技术的临床应用[J].中华医学杂志,2008,88(39):2 755-2 758.

[5] 刘卫卫,孙莹璞,宋文妍,等.卵母细胞玻璃化冻融21例临床分析[J].现代妇产科进展,2010,19(3):165-167.

[6] 吴 欢,张静静,贺小进,等.取卵日男方取精困难的应对策略及助孕结局分析[J].生殖与避孕,2014,34(10):813-818.

[7] 高兴成,胡 鹏.取卵日因手淫取精失败改行手术取精及时干预对于卵胞浆内单精子注射结局的影响[J].中华临床医师杂志:电子版,2012,6(13):31-34.

[8] Boiso I,Martí M,Santaló J,et al.A confocal microscopy analysis of the spindle and chromosome configurations of human oocytes cryopreserved at the germinal vesicle and metaphase Ⅱ stage[J].Hum Reprod,2002,17(7):1 885-1 891.

[9] 邢 琼,章志国,周 平,等.人类未成熟卵母细胞玻璃化冷冻研究[J].生殖与避孕,2008,28(10):593-597.

[10]Shaw-Jackson C,Van Beirs N,Thomas AL,et al.Can healthy babies originate from oocytes with smooth endoplasmic reticulum aggregates? A systematic mini-review[J].Hum Reprod,2014,29(7):1 380-1 386.

唐永梅(1975～)，女，本科，副主任技师，研究方向：辅助生殖实验室技术。

R 714.13

B

0253-4304(2016)04-0579-02

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.04.41

2015-11-30

2016-02-23)