uPAR放射性核素靶向显像研究进展

孙芳芳 张欣

116011，大连医科大学附属第一医院核医学科

uPAR放射性核素靶向显像研究进展

孙芳芳 张欣

116011，大连医科大学附属第一医院核医学科

尿激酶型纤溶酶原激活物及其特异性受体（uPA/uPAR）系统是肿瘤侵袭、转移和血管生成的核心环节之一，且与肿瘤的不良预后密切相关。检测肿瘤组织中uPA/uPAR表达水平及其随病情的变化情况，对于肿瘤预后判断、治疗方案的选择与疗效评价意义重大。放射性核素分子靶向显像方法在靶向受体表达水平测定上具有独特的优势，近来年医学研究者使用多种放射性核素标记uPAR的特异性配体进行了动物显像研究，并于2015年首次用于人体显像。笔者就近年来uPAR放射性核素靶向显像的研究进展作一综述。

放射性核素显像；尿纤溶酶原激活物；靶向显像

Fund program:Liaoning Province Natural Science Fund Project（2013023017）

近年来随着分子生物技术的飞速发展，医学研究者对肿瘤侵袭和转移的分子机制有了进一步了解，其中尿激酶型纤溶酶原激活物（urokinase plasminogen activator，uPA）及其特异性受体（urokinase plasminogen activator receptor，uPAR）的表达备受关注[1-3]。uPA/uPAR是基质降解酶系统的重要组成之一，肿瘤细胞分泌的uPA是纤溶酶形成的启动物，uPA与uPAR结合后被激活，通过蛋白水解及信号传导途径启动一系列反应，对肿瘤的侵袭和转移有明显的促进作用，还可通过上调凋亡抑制因子的表达，起到抑制肿瘤细胞凋亡的作用[4-9]。uPA/ uPAR在多种肿瘤组织中高表达，其表达不仅是肿瘤侵袭与转移的核心环节，还与肿瘤的恶性程度与不良预后密切相关。以uPAR为靶向的治疗已成为肿瘤治疗新途径[10-13]，放射性核素靶向显像可提供肿瘤uPAR表达水平高低的信息。近年来，很多课题组对uPAR靶向显像进行了研究并发表了他们的研究成果，综述如下。

1 SPECT显像

uPA与uPAR有着很高的亲和性，有研究表明uPA与uPAR结合的结构为NH2端生长因子样结构区（growth factor-like domain，GFD）的β折叠结构[14-15]。Magdolen等[16]合成了包含这一区域的部分氨基酸的肽链，并测试了其与uPAR的亲和力，其中cyclo21，29[D-Cys（21）Nle（23）Cys（29）]uPA、cyclo19，31[D-Cys（19）]uPA 两个环状肽链与uPAR有较高的亲和力。Armstrong等[17]尝试通过在cyclo19，31[D-Cys（19）]uPAmoduan上连接一个可以直接与99Tcm螯合的氨基酸，合成了99Tcm标记的环状肽链，但是实验发现，其与uPAR的结合能力下降，只能达到uPA结合能力的3%左右，不适合进行SPECT显像研究。

uPAR的拮抗剂AE105（D-Cha-F-s-r-Y-L-W-S）是含有9个氨基酸的直线肽链，它与uPAR有很高的亲和力，Cha、F和W 3个氨基酸在与uPAR的结合中起重要作用，将其中的W更换为E时，其与uPAR的结合能力显著下降，不再具有特异性结合能力，这种肽链称为AE105mut。AE120[（D-Cha-F-s-r-Y-L-W-S）2-βA-Kc]是含有双链AE105的多肽，与uPAR也有很高的亲和力，很多显像与治疗实验都是以AE105或其衍生物作为底物进行研究[18-19]，以AE105mut作为阴性对照肽链。

2009年Liu等[20]合成了一种类似AE120的双链多肽（AE120 analogue），通过在C-端连接1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N'，N''，N'''-四乙酸（1，4，7，10-tetraazacyclododecane-N，N'，N''，N'''-tetraacetic，DOTA）螯合剂与111In结合。AE120 analogue多肽分子在体外与uPAR的结合能力较AE105稍有下降。在荷人MDA-MB-231型乳腺癌裸鼠体内，111In-AE120 analogue注射4 h后，在肿瘤组织中的分布明显高于肌肉组织和血液，111In-AE120 analoguemut并无此特异性摄取现象，但在肝、肾中的分布值远高于肿瘤组织，这将会影响其在实际中的应用。

99Tcm是临床上最常用的放射性核素，笔者所在课题组曾在2013年尝试使用99Tcm标记AE105制备更适合于临床应用的uPAR显像剂[21]，在AE105的NH2端连接聚乙二醇柔性分子和肼基尼古酰胺螯合剂，通过Trcine协同配体与99Tcm螯合，用同样的方法标记阴性对照肽链AE105mut，以高表达uPAR的bxpc-3荷瘤裸鼠为模型测试了标记化合物的生物分布，结果发现，99Tcm-AE105在肿瘤组织中的摄取率明显高于阴性对照化合物99Tcm-AE105mut，并且肿瘤组织的放射性摄取率与免疫组化测定的uPAR表达呈正相关；此外，还进行了uPAR的SPECT显像，显像剂注入体内2 h可隐约看到肿瘤组织显影，4、6 h时肿瘤组织显影清晰（T/NT分别为3.37±0.11和3.64±0.25），而对照组（99Tcm-AE105mut）始终无法从图像中清楚地看到肿瘤组织显影（T/NT分别为1.36±0.18和1.28±0.20）。99Tcm-AE105显像剂在血液、肝脏、肾脏中持续滞留，这不仅对图像质量造成一定影响，在临床应用中也会降低肿瘤病灶的检出率，作为uPAR靶向显像剂，还需要进一步改进和完善。

2010年Duriseti等[22]通过噬菌体展示技术得到了可以与uPAR结合的3种特异性抗体片段，分别命名为2G10、1A8和3C6，它们与uPAR的结合能力与uPA相似。2014年Lebeau等[23]在研究抗药性乳腺癌细胞uPAR的表达时，使用111In标记2G10、1A8和3C6用于uPAR显像，其中111In-2G10在体内外均与uPAR有很好的亲和性，具有良好的生物学性能；给予MCF-7 TamR（一种人乳腺癌细胞）荷瘤小鼠尾静脉注射显像剂24 h后，显像剂开始在肿瘤组织中浓聚，72 h时显像剂在肿瘤组织中的分布达到最大值，肿瘤与血液的放射性摄取率比值（T/B）达到了12，肿瘤与肌肉放射性摄取率比值（T/M）更是高达96，与以前的报道[20]相比，显像剂在肝脏与肾组织中的摄取率有了显著降低；MDA-MB-231 DoxR和MDA-MB-231 TaxR（两种人乳腺癌细胞）荷瘤小鼠体内生物分布数据与MCF-7 TamR荷瘤小鼠数据相似，而在不表达uPAR的MCF-7荷瘤小鼠体内，生物分布实验显示标记物与肿瘤组织没有特异性结合能力，肝脏、肺和血液中的放射性摄取率明显升高；SPECT显像图像与生物分布数值相符合。

2 PET/CT显像

Li等[24]于2008年首次尝试使用64Cu标记AE105多肽作为uPAR的显像剂，他们在肽链的氨基端链接DOTA螯合剂，并在体外测试了DOTA-AE105与uPAR的结合能力，结果显示，连接DOTA后，肽链与uPAR的结合能力稍有下降，microPET显像结果显示，64Cu-DOTA-AE105在U87MG人胶质母细胞荷瘤小鼠体内，可特异性浓聚于肿瘤组织中；注射显像剂1 h后即可清晰地看到肿瘤组织显影，4.5 h后达到一个平台期；而在相同条件下不表达uPAR的MDA-MB-435人乳腺荷瘤小鼠体显像图像中则没有发现肿瘤组织中显像剂的浓聚；阴性对照物64Cu-DOTA-AE105mut及uPA抑制显像实验进一步证实了64Cu-DOTA-AE105的靶向性；免疫组化测定的肿瘤细胞uPAR表达程度与64Cu-DOTAAE105的摄取呈正相关。

Persson等[25]对64Cu标记AE105进行了深入研究，研究对肿瘤组织对64Cu-DOTA-AE105的摄取与uPAR的表达相关性进行了定量分析，并将uPAR PET显像与18F-FDG显像进行了对比，U87MG人胶质母细胞荷瘤小鼠进行64Cu-DOTA-AE105 microPET显像，处死后对肿瘤组织进行uPAR表达水平的酶联免疫吸附及免疫组化方法检测，结果显示，microPET显像中肿瘤组织的放射性摄取率与酶联免疫吸附测定及免疫组化检测方法中uPAR的表达水平具有相关性，实验证实了64Cu-DOTA-AE105的microPET显像可以定量地提示uPAR的表达水平；而18F-FDG PET显像显示，在uPAR表达水平不同的肿瘤组织中，18F-FDG的摄取并没有明显差异。实验中发现肝脏对显像剂具有很高的摄取率，这对其在临床上的应用具有较大影响，64Cu通过DOTA螯合剂标记的其他多肽显像剂在动物体内也有这种现象，这是因为64Cu-DOTA在体内不稳定，64Cu与肝脏中超氧化物歧化酶发生金属离子交换所致。

CB-TE2A和CB-TE2A-PA是两种新型的螯合剂，文献报道它们与64Cu的螯合物在体内的稳定性优于64Cu-DOTA[26]。Persson等[27]将这两种螯合剂连接在AE105氨基端，用64Cu标记合成了新的uPAR显像剂，体外亲和力测试显示，CB-TE2A-AE105和CB-TE2A-PA-AE105与uPAR的结合力和DOTAAE105相当，64Cu-CB-TE2A-AE105及64Cu-CB-TE2APA-AE105的体外稳定性远远优于64Cu-DOTAAE105，这与之前文献报道结果一致；对这3种显像剂的PET图像通过ROI技术方法进行分析，注射显像剂1 h后，3种显像剂在肿瘤组织中的摄取率相似，但肝脏对64Cu-CB-TE2A-PA-AE105的摄取率远低于另外两种。他们认为这是目前生物性能最佳的uPAR PET/CT显像剂，具有高的肿瘤与血液的放射性摄取率比值，且肝摄取率不高。螯合剂选择的改变改善了显像剂的生物学性质。

由于64Cu价格昂贵且不易得到，Persson等[28]还尝试使用可以由发生器装置得到的68Ga和常见的18F标记AE105多肽分子进行uPAR显像。68Ga-NODAGA-AE105-NH2和68Ga-DOTA-AE105-NH2两种标记物在体外稳定性良好，且与U87MG（一种恶性胶质瘤细胞）在体外的亲和力高。microPET显像图像中见到显像剂在肿瘤组织中的特异性浓聚，但较64Cu-DOTA-AE105肿瘤摄取率明显降低，肿瘤/肾、肿瘤/肌肉值低，作为PET显像剂仍需进一步改进。

18F是PET最常用的放射性核素，它的生物学性质及半衰期都非常适合用于PET显像。Persson等[29]使用18F-AlF标记DOTA-AE105用于uPAR的显像。前列腺PC-3荷瘤小鼠静脉注射18F-AlF-NOTAAE105[1，4，7-三乙酰唑胺环壬烷-1，4，7-三乙酸盐（1，4，7-triazacyclononane-1，4，7-triacetic acid，NOTA）]后行PET显像。通过ROI技术分析图像，结果显示肿瘤组织有较高的放射性摄取率；在竞争抑制实验中，注射显像剂1 h后，肿瘤组织的放射性摄取率从（4.22±0.13）%下降至（0.86±0.14）%，证实了18F-AlF-NOTA-AE105的靶向特异性。体内分布实验显示，显像剂在骨中也有分布，与18F-FDG的骨摄取率相似（1.5 h时为2.49%ID/g），但并不影响其临床使用。

2014年Persson等[29－30]还在小鼠体内进行了64Cu-DOTA-AE105的放射性剂量学研究，在此基础上，2015年他们首次进行了64Cu-DOTA-AE105人的体内实验[31]，该实验纳入了3例乳腺癌患者、4例前列腺癌患者和3位转移性膀胱癌患者，注射剂量约为204 MBq，患者在注射显像剂前后各种体征及生化指标均无明显变化，64Cu-DOTA-AE105安全性较好，实验结果发现，显像剂在体内的摄取率由高到低依次为膀胱＞肝脏＞肾脏＞胰腺，正常脑组织中无显像剂摄取；药物代谢实验表明，显像剂在体内被代谢成为一种亲脂性更强的化合物，通过尿液排出体外，3 h内显像剂快速从体内清除，24 h时除肝脏及肠道有药物聚集外，其他器官及肿瘤组织中的显像基本被清除干净。在该研究中，除1例患者因为幽闭恐惧症只做了1 h的显像外，其他9例患者分别在1、3和24 h显像，注射显像剂1 h后肿瘤原发灶与淋巴转移灶均可清晰显像，10例患者的原发灶阳性率达到100%，1例转移性膀胱癌患者肝脏上的转移病灶未被检出，这可能与肝脏的高摄取率相关，1例乳腺癌患者的脑部在检测时发现有轻微的显影，后经MRI证实为脑内转移病灶。64Cu-DOTA-AE105在该研究中显示出了优秀的生物性能，虽然肝脏摄取率高可能影响肝脏组织中病灶的检出，但在注射1 h后即可清晰显影，并不影响AE105作为uPAR显像的靶向物在临床上的使用。

3 小结

uPAR靶向显像研究目前仍处在初始阶段。虽然医学研究者已合成多种uPAR靶向显像剂，但都有着各自的不足，uPAR显像进入临床实际应用仍有很长的路要走。

有研究表明，在人体内，肿瘤高表达uPAR的同时，体内uPA的浓度也显著增加，很大一部分uPAR可能已与uPA结合[32]，这对显像剂在肿瘤组织的摄取会有很大影响。选择与uPA结合位点不同的靶向分子结构，可能会提高肿瘤组织对显像剂的摄取，提高靶/本底比值。螯合剂的连接可能会改变多肽分子空间，而且螯合剂对标记化合物的稳定性有直接的影响，选用合适的螯合剂也会改善显像剂的性能。

利益冲突 本研究由署名作者按以下贡献声明独立开展，不涉及任何利益冲突。

作者贡献声明 孙芳芳负责搜集、整理文献，撰写论文；张欣负责审校论文。

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Research progress of uPAR-targeted nuclear imaging

Sun Fangfang,Zhang Xin
Department of Nuclear Medicine,the First Affiliated Hospital of Dalian Medical University,Dalian 116011,China

Zhang Xin,Email：zhhw2000@126.com

Urokinase plasminogen activator（uPA）and urokinase plasminogen activator receptor（uPAR）system play an important role in the process of cancer invasion,metastasis and angiogenesiss,and it is closely associated with poor prognosis of tumors.Evaluate of uPAR expression level in the tumor cell is very significant for cancer prognosis,selection and assement the therapy.Molecular targeted nuclear imaging has unique advantage in testing receptor expression,several research group labeled uPAR specially ligands with different radionuclides for imaging uPAR.The first human uPAR imaging has taken in 2015. This article reviewed the research progress of uPAR-targeted molecular nuclear imaging in recent years.

Radionuclide imaging;Urinary plasminogen activator;Targeted imaging

张欣，Email：zhhw2000@126.com

10.3760/cma.j.issn.1673-4114.2016.03.013

辽宁省自然科学基金（2013023017）

2016-01-11）