植物体细胞胚发生的激素调控

曹劼

（福建省将乐县林业局 353300）

植物体细胞胚发生的激素调控

曹劼

（福建省将乐县林业局 353300）

随着生物科技的不断发展，植物体细胞胚胎发生的技术随之兴起，该技术的应用不仅让植物快速繁殖的目标得以实现，同时为植物胚胎发生机理、遗传转化系统的形成提供了帮助。本文通过植物五大激素对植物体细胞胚胎发生的调控及其作用机制的介绍进一步对其研究进展进行探讨。

植物激素；体细胞胚发生；调控；发生机制

1 前言

一般情况下可以将植物体细胞发生（Somatic Embryogenesis）理解为在对体细胞进行离体培养时，不和性细胞进行融合，利用与受精卵相似的方式构成新个体形体的演变过程，通过细胞胚产生的胚胎结构，可以将其称为胚状体或者体细胞胚（本文下面简称体胚）。从20世纪50、60年代开始，Steward、Reinert等研究学者分别从胡萝卜悬浮细胞系、固体培养的胡萝卜愈伤组织中获取体胚后，相关学者在就在该新领域展开了大量研究并取得显著的成果。体胚发生的研究进展迅速，在2000年前就果树方面而言，已有28科43属93种杂种的果树在离体条件下形成了体胚。

2 植物激素调控体细胞胚胎发生

近年来对激素调控体胚发生的研究进展迅速，但这种调控十分复杂，比如多种植物激素发生的生理作用具备一定的专一性，但是其各异的生理效应是由于不同类型激素间的相互作用产生的。同一激素能对多个发育的进程进行调控，并且其同种特性的发育过程中需要由多种不同的激素相互协作，同时各种激素对不同植物及同一植物不同阶段的体胚发生作用各异。合理使用相应激素对体胚发生起重要调控作用。

2.1 生长素与细胞分裂素对体胚发生的调控

自1928年荷兰F.W.温特从燕麦胚芽鞘尖端分离出一种具生理活性的物质称为生长素以来，随着研究的进展，生长素被广泛用于相关研究中，本章节将就此对生长素和细胞分裂素给体胚开展调控进行综述。通常情况下会认为,生长素是诱导体胚发生的关键因素。常用的生长素有IAA，NAA和2,4-D。其中2,4-D在胚性愈伤组织的诱导中起着重要作用，对多种类型植物组织进行脱分化培养过程中必须使用2,4-D进行调控，其中尤以需要较高浓度的2,4-D单子叶植物最为突出。细胞分裂素主要是通过促进细胞分裂而促进体胚生长，最常用的细胞分裂素有KT和6-BA。Gaj对不同物种利用生长调节物质诱导体细胞胚的基本情况进行了分析和统计，并研究情况指出其中有80%的植物能够通过生长素单独诱导或与细胞分裂素相结合的方式进行体胚的诱导；同时明确提出在多数的研究中会使用2,4-D。另外在多项对植物体细胞胚发生研究的过程中都会利用生长素和细胞分裂素相结合的方式，使其诱导体胚得以顺利进行。

多数植物的体细胞胚发生都需要通过生长素和细胞分裂素结合的方实现。只添加生长素能让胡萝卜体细胞胚被诱导，而再次添加浓度较低的玉米素则能使其发生率被大幅度提升并实现同步化。例如2,4-D和KT的比例不同时，都会对植株再生途径产生影响，当培养基中为0.1mg/L2,4-D时该结果更倾向于体细胞胚的发生,当为0.2mg/LKT和0.1mg/L2,4-D时则会利于器官发生。在DKW的培养基中附加6-BA1.1mg/L和KT2.0mg/L以及IBA0.01mg/L时，对于核桃愈伤组织的诱导有着显著效果,而当其培养基中只含细胞分裂素时,使核桃体细胞胚的发生容易被诱导。相关研究学者根据其特性配置了15种不同配比的激素组合，并对利用2,4-D和BA等对百合鳞片叶器官发生和体细胞胚胎发生进行研究,最终试验结果显示:利用MS培养基进行培养，BA主要是对植体直接分化不定芽进行诱导；而2,4-D则对体细胞胚胎发生直接进行诱导,当2,4-D浓度为4.0mg/L时，其体细胞胚胎发生的诱导效果最好；而当培养基中同时存在BA和2,4-D时,两种现象都会出现。

2.2 脱落酸ABA对体胚发生的调控

在进行植物体细胞胚胎发生的过程中脱落酸有着重要的作用，也是其中的重要激素。据研究结果显示，使体细胞胚得以成熟关键因素是ABA，其作用在于能让细胞胚快速成熟，避免出现裂生多胚的情况，进而造成畸形胚。早在1974年,Ammirat就关于ABA能促使葛缕子（CarumcarviL.）体细胞胚胎快速发育进行了报道。而Kamada等研究人员在进行胡萝卜细胞培养过程中,发现其ABA含量一直处于偏低的状态,但是由非胚性细胞转变为胚性细胞和从胚性细胞团发育形成有形态结构的球形胚两个质变发生阶段中,ABA的含量均有所增加。根据唐巍等研究人员的实验显示：在对针叶林木体胚发生进行研究中ABA有着重要影响，因此在进行体胚分化培养中添加ABA能使体胚发育成熟率加快。过去ABA主要是用于加快野蒿（Artemisia campestrisL.）和大豆（Glycine max（Linn.）Merr.）的体细胞胚成熟中。而近年来 Fowke和Attree研究人员发现，当使白云杉（Picea glauce（Moeach）Voss.） 未成熟体细胞胚放置在 ABA （16～22μmol·L-1）和PEG4000（7.5%）的组合物中一段时间后，不仅能有效的抑制早熟萌发，对于成熟频率的提升和形成较高质量的胚有着重要影响。并且该结论和廖宇赓进行台湾云杉（Picea morrisonicola Hayata）试验的结果相似。此外相关研究显示，在对防风体细胞胚进行培养的过程中，添加,附加0.5-1.0mol/LABA，能让次生胚的形成被成功移植，同时避免了畸形胚状体的发生。陈金慧等在杂交鹅掌楸体细胞胚胎研究中指出ABA的使用能有效控制畸形胚的产生。研究表明，不管是外源ABA与内源ABA都能使体细胞胚发生实现调节和促进作用，通过添加4.0μmol/L外源ABA的方式使体细胞胚发生频率与质量明显提升。

根据Dennis等的实验显示,当在含有200mmol/L蔗糖的培养基中添加2mol/LABA时，能让其体细胞胚的数量得到有效的提升，和王清连等研究结果具有一致性。但是在魏岳荣等研究中发现当在香蕉体细胞胚诱导初期时添加一定浓度ABA时，会使体细胞胚的发生受到移植,严重者让其在萌发时出现严重的愈伤化。此项研究差异还需进一步进行说明。

2.3 赤霉素对体胚发生的调控

赤霉素在植物组织培养中研究较多的是具有生理活性的GA1、GA3。其突出的作用是加速细胞的伸长，提高植物体内生长素的含量，对细胞的分裂有促进作用，并促进细胞的扩大。由于很多植物在无赤霉素的情况下都能生成体胚，可能其内源GAs能够满足体胚发生需要。因此，关于赤霉素（GAs）调节体胚发生和发育的报道较少。

吴蝴蝶等研究指出GA3在橡胶体细胞胚萌发成苗中起重要作用，其用量在0.5～1mg/L较合适,不宜超过2mg/L。根据张宝红等研究证实，当培养基中GA3含量较高时，会出现陆地棉畸形胚的情况发生，这对于植物体细胞胚发生来说是极为不利的。而赤霉素在对苹果、梨、红醋栗、樱桃等果树的体胚发生中有着积极作用同时,在柑橘中则会出现利弊并存的现象。

2.4 乙烯对体胚发生的调控

在植物体能广泛分布且能起到调节作用的是乙烯和多胺等物质。因为在实验过程中的组织培养时处于密封或半密封的容器中，这就使得乙烯的积累不能被避免，并且对于体胚发生和发育有着一定的影响。乙烯虽然对胡萝卜愈伤组织中的体胚发生有着抑制作用，但是该物质产生的抑制剂，例如Co2+、Ni2+等能让乙烯的产生被抑制的同时使胡萝卜体胚发生率被提升。多胺对于DNA负电荷有着中和效果,并且能使其结构相对稳定,其DNA结构的稳定程度跟体细胞胚发生与发育的遗传基础的情况有着一定的联系。多胺对于体胚发生的促进和制止乙烯合成有着一定的联系。当将乙烯和多胺生物进行融合时能有效的对体胚的发生和发育进行调控。有些研究表明乙烯对体胚的发生有着利弊影响,同时也有相关研究显示当植物的品种或材料的胚性强弱不同时，其影响也就不同,并且还有研究显示,乙烯不会对体胚的发生造成显著的影响。黄学林等研究得出：乙烯抑制体细胞胚发生,但能促进体细胞胚的成熟。当体细胞胚的种类和发育阶段存在一定的差异时，其培养容器中累积的乙烯产生的利弊效果也会不同。造成这些结果存在差异性的原因和物种以及处理方式差别有着一定的联系，同时乙烯的量也有着一定的影响，该物质的具体作用机理还需要由相关人员进一步研究分析。

3 激素调控体细胞胚胎发生的机制

在植物体细胞的发生过程中植物激素不是直接作为生长素而存在的，而是需要利用内源激素含量变化发挥作用。相关研究有结果显示：2,4-D主要是利用细胞内源IAA代谢而发生的，其内源性IAA含量的上升或维持在较高的水平是胚性细胞出现的一个共同标志。据相关的学者研究显示，将胡萝卜组织置于培养中，外源2,4-D有利于内源IAA大量积累，胡萝卜细胞胚胎发生的能力与内源IAA水平的升高密切相关。一些激素通过影响DNA甲基化程度，由于甲基化能够影响基因的失活和表达，从而影响体胚的发生。理想状态下的DNA甲基化水平有利于正常的体胚发育,但是当DNA甲基化程度过高或过低使都会迅速对体胚发生造成抑制，Loschiavo等观察到，2,4-D的浓度与否和细胞核DNA甲基化情况有着直接联系，当将胡萝卜悬浮培养物培养在含高浓度2,4-D的培养条件中时，其细胞核DNA甲基化也会随之增加，而基因表达活性则会下降；当除去或降低2,4-D浓度时，其细胞核DNA的甲基化会明显降低，进而使相应的基因被激活。

就体细胞胚胎发生本质而言主要是因为体细胞受到各种内外因素的影响,进而使某些特异基因的表达被开启,主要体现为胚性蛋白的产生。在体细胞胚形成中植物激素有着一定的有调节作用，促进或抑制相关基因的表达，从而实现对体胚发生的调控。在胡萝卜的各种基因中Dcarg-1会受到生长素调控的影响,并且只处于诱导前期进行表达,由此可见生长素处理能够形成一种胁迫环境,容易造成触发体胚的发生。在对烟草细胞进行悬浮培养过程中，利用2,4-D对生长素饥饿的细胞进行处理，并在15～30min后，其中的mRNA开始积累，经过cDNA文库进行差异性筛选后，得出7种2,4-D诱导的mRNA，其中有3种属于生长素初期应答基因，学者根据这个结果判断编码的蛋白可能与细胞分裂的起始有一定的联系。目前,与胚发育密切相关的基因有（LEA）基因、体胚分泌蛋白基因、胚根发育相关基因、脂体跨膜蛋白基因、（SERK）基因、与翻译有关的延伸因子EF21的基因等。这些基因中的大多数会因为外源激素造成影响，进行出现差异的表达。LEA基因编码中的LEA蛋白属于在胚胎发生后期种子中占比较大的一系列蛋白质，容易因为ABA和脱水信号的影响，并且能在种子脱水过程中对其胚胎的保护。Kim等研究学者对苜蓿的高胚性和低胚性进行培养,最终结果显示NAA也许是对MtSERK1的上游正进行调控的物质,而BAP则是利用NAA的作用使NAA诱导效果被提升，2,4-D也可能参与了胡萝卜和鸭茅培养时的SERK基因表达调控。

4 体细胞胚发生存在的问题及展望

目前对植物体胚发生研究虽然取得较大的进步，并且其部分的研究成果在园艺和林业等生产中得到应用。但是实际的应用和研究过程中仍有问题存在。比如体胚转换率的提高和体胚发生的遗传稳定程度的控制力度以及体胚发生的分子机理等方面的问题有待处理和探讨。与此同时,为了使体细胞胚发生的实质得以体现，需要对其体细胞胚发生的分子机制进行深入研究,其中尤以离体培养状态下细胞分化时基因差异的表达和机理的调控等，而高通量测序技术的不断发展将为其研究带来更大的方便。

Q944.46

A

1005-7897（2016）02-00103-02

2016-1-9