ABC家族转运蛋白及应对抗生素耐药性的概述

任远 司维 任恒 李冲 李璐璐 王霆(河南省人民医院药学部 河南郑州 450003)



ABC家族转运蛋白及应对抗生素耐药性的概述

任远 司维 任恒 李冲 李璐璐 王霆
(河南省人民医院药学部 河南郑州 450003)

【关键词】细菌;耐药泵;治疗手段

细菌已经衍生出许多巧妙的策略来抵抗微生物的治疗:靶点修饰,药物失活,酶降解,或者是降低细胞内药物浓度(亦或是降低稳定性､促进药物的外流)｡在这诸多策略之中,外流策略是最为普遍也最为基础的机制,然而目前而言,这种机制似乎最为重要是因为它具有授予细菌多重耐药性(MDR)表现型的能力,从而导致一些细菌株能够对目前所有已知的治疗产生耐药性[1]｡在外泵机制中所起作用最显著和广泛的当属ABC转运蛋白家族(ATP-binding cassete transporter proteins,ABC Protein)｡本文将就原核生物中ABC家族转运蛋白的结构,它们与抗生素耐受性以及与抗细菌治疗策略的关系展开论述｡

1 简介

外流泵参与了细菌内许多生理功能:它们主要被视为“细胞清洁者",但它们同样在细菌致病过程中发挥重要作用[2]｡在抗生素治疗的压力下,它们会发生高表达从而提高抗生素的最小抑菌浓度(MIC),使耐药性机制进一步加强,最终导致抗菌治疗的失败｡由于一些转运分子是由可移动的基因片段所编码,导致这种耐药性机制会在种内和种间迅速传播,从而进一步增加寻找合适治疗方案的难度,并对环境中细菌耐药性的免疫因子施加了选择性的压力[3]｡

细菌外流转运蛋白主要是由Ⅱ-型转运蛋白(取决于质子动力或是钠离子动力)组成｡Ⅱ-型转运蛋白主要属于以下几个蛋白家族:多药及毒性化合物外排转运蛋白(MATE),主要协助转运蛋白超家族(MDF),抗结核分离蛋白(RND)以及小多重耐药性转运蛋白(SMR)家族｡然而,ABC家族的MDR转运蛋白在革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中均已见报道[4],并且对于原核菌种的大量基因分析工作使许多假想的ABC家族的外流泵得到了证实[5]｡最近,一个细菌ABC蛋白(与多重耐药性相关)的晶体结构已被测定,使能量耦合与转运的分子机制得以被窥探[6-7]｡许多ABC家族转运蛋白都与抗生素耐受性有关;在它们当中,有一些授予了细菌以多重耐药性的表现型,使细菌表现出对于多种､混合的抗生素的耐药性｡最近,在对转基因植物的抗生素保护中,一种植物来源的ABC家族转运蛋白被作为耐受性的决定因素加以使用;结果表明,当该种ABC家族转运蛋白过度表达时,植物对于卡那霉素产生了显著的耐受性,说明这些外流系统或许可以有效地保护活体细胞免于抗生素的作用[8]｡

2 细菌中的ABC家族转运蛋白确与抗生素耐受性有关

首见报道的与抗生素耐受性有关的细菌ABC家族转运蛋白是MsrA,一种从葡萄球菌中分离得到､由质粒编码的转运蛋白｡这种转运蛋白与细菌对14/15碳大环内酯类抗生素､B-型链阳霉素的耐受性有关[9]｡90年代初细菌产生多重耐药性的机制就已在二级反向运输系统中见报道[10],首次发现与多重耐药性有关的细菌ABC家族转运蛋白是1996年在乳球菌中得到的LmrA[11]｡似乎这些二级蛋白与抗生素耐受性､抗菌治疗的失败有所关联(特别是革兰氏阴性菌种来自MFS和RND蛋白家族的二级蛋白)｡这些多重耐药性转运蛋白中的许多都被研究过,例如金黄色葡萄球菌中的NorA,或者是绿脓杆菌中的MexAB-OprM系统｡并且,现已发展了许多规避上述蛋白的治疗策略｡

然而近些年,对于细菌ABC家族外流系统对抗生素耐受性的贡献却少有报道｡并且这些转运蛋白在抗生素生产器官中的作用主要被认为是分泌药物并对生成的抗生素产生自卫性､耐受性[12]｡如今,随着许多菌种的基因测序工作已经全部完成,分子生物学技术(基因敲除与过度表达研究)也得到长足进步,大量假象的ABC家族的转运蛋白已经被发现｡它们当中越来越多被证实与许多菌株的抗生素耐受性有关｡所有这些转运蛋白都表现出显著水平的抗生素耐受性(对照组与转运蛋白表达的组之间MIC值至少有4倍的差异)｡几乎每类抗生素都受到了影响,并且ABC家族转运蛋白催化的抗微生物药物的主动外流过程,在革兰氏阳性和革兰氏阴性菌种均有发生｡在所有被发现的转运蛋白之中,很少被视为是多重耐药性蛋白[13],而是更多地被称为小MDR蛋白(SDR)｡在考虑药物治疗策略时,多重耐药性泵更为重要,因为它们与细菌对多种抗生素的适应过程有贡献,从而导致产生越来越多的菌种特异性耐药机制,最终可能产生十分耐受的菌株,对临床研究和社会防治都产生巨大的威胁｡

被研究最多的细菌ABC家族多重耐药性转运蛋白是乳酸菌中的LmrA｡这个基因编码的蛋白与人体的P-糖蛋白(P-gP)具有结构上的同源性,然而其与P-gP不同的是,Lm rA是由两个半转运蛋白构成,并以同源二聚体的形式发挥功能[14]｡这种转运蛋白在药物耐受的大肠杆菌株中表达,并发现其可导致对多种抗生素和其他药物(这些药物在结构上和功能上都无联系)的耐受性｡其他的具有广谱底物亲和性的多重耐药性ABC家族泵也在细菌中得以发现,然而此处我们只关注那些与临床使用抗生素耐受性相关的多重耐药性ABC家族转运蛋白｡基于如此意图,缺少一些主要多重耐药性转运蛋白的耐药菌株将会是非常棒的工具,从而用于确定多重耐药性外流泵的潜在底物范围｡其他主要的与抗生素耐受性有关的多重耐药性ABC家族外流泵包括EfrAB､VcaM和MacAB｡鉴于其命名和底物范围,后面两种更像SDR转运蛋白家族的成员｡为了纪念这个发现,这两种耐受且不断增长的菌株被分别命名为SP2073和SP2075[15]｡

细菌中多重药物的外流机制正被广泛讨论,而且几乎无争议地认为多重药物的外流泵是染色体编码的,然而药物特异性的外流机制似乎更可能是质粒或者其他可移动的基因片段(如转位子,干扰素)编码的｡后一种机制促进了菌种间的横向转移,并且使得耐受性决定因素如外流泵得以迅速分散传播[16]｡这一情况加重了多重耐受性(无论是致病菌还是非致病菌)菌种的发展情况,甚至可能导致公众健康的隐患,成为一个环境问题｡

3 ABC家族转运蛋白在抗微生物治疗策略中的应用

在人类治疗方面,ABC家族转运蛋白对于抗肿瘤药物的研究是不可缺少的｡关于抗菌治疗,MDR和外排方面的兴趣(关注)在近10 a得到提升,这个现象,现在被认为是固有的和同样伴随过表达,作为一种获得性耐药机制,很大程度上造成现在抗生素治疗的弱点｡特别是细菌次生转运蛋白驱动的外排,大部分研究已经开展或正在进行中[17]｡细菌的ABC家族转运蛋白很少被关注因为它们涉及抗生素外排的描述较少｡尽管如此,最近在分子生物学和细菌基因工程方面的发现和进展,提供了对于细菌外排过程的一个更好认识｡随着越来越多转运蛋白被鉴定,ABC家族转运蛋白似乎在多药(包括抗生素)耐药方面发挥着不可忽视的作用｡同样,其在环境适应和细菌生存方面具有相应的重要性,结合现在的三维结构解析,使它们成为新抗菌策略的潜在靶点｡

3.1 细菌的ABC家族转运蛋白作为免疫治疗的靶点 众所周知,ABC家族转运蛋白可能具有免疫原性,特别是位于表面的蛋白像外膜蛋白(OMPs)和(或)SBPs,提示它们可能被开发成针对治病菌株的疫苗的候选亚基｡针对这些蛋白增加的重组抗体在感染小鼠模型的细菌中减少[18]｡因此,有可能通过使用DNA疫苗使细菌过表达这些免疫原性的成分｡这些疫苗的例子已经被用来评价分枝结核杆菌感染,这些针对静脉内感染的有效保护通过使用PstS-3得到证实,PstS-3是涉及磷酸盐转运的结核分枝杆菌SBP中的一种[19]｡

ABC家族转运蛋白组分位于革兰阴性菌的细胞膜内,同样能够刺激特定免疫反应,因为靶向细胞质蛋白的抗生素已经用于恢复期血清(convalescent sera)[20]｡进一步研究需要确认位于膜内的蛋白刺激抗体反应的过程｡这个将提供更多的把ABC家族转运蛋白作为DNA疫苗的合理方法｡

此外,当用于和抗生素联用时免疫治疗可能得到加强｡针对甲氧西林耐药S.aureus(EMRSA-15)ABC家族转运蛋白肽提高的重组蛋白和万古霉素的联用已经结束3期临床实验,这个药物联用的所有反应(细菌和临床)比安慰剂和万古霉素联用观察到的结果好｡

3.2 逆转外排机制造成的细菌耐药性 在治疗细菌耐药的过程中,面对MDR耐药基因或者外排机制引起的耐药性,除了发展新型的对外排泵不敏感的药物,几乎所有的策略都是选择一种“外排泵抑制剂"与抗生素联用来达到逆转临床上治疗耐药菌时产生的局限性[21]｡这个思路极具合理性和前景,原因如下:①几乎所有抗生素都产生了多药耐药现象(即使近来上市应用到临床的,如奎奴普丁-达福普汀,泰利霉素,替吉环素和利奈唑胺等);②应用于合用策略的抗生素已经证实他们在野生型菌株上的有效活性,并且已经有很丰富的毒性和生物利用度等相关数据资料的积累;③临床上已经证实一些耐药抑制剂与抗生素的联合应用非常有效,比如克拉维酸钾/阿莫西林就广泛应用于临床治疗上｡为了在细菌细胞内积聚更多的药物,外泵抑制剂可以促进药物的摄入或者抑制外泵对药物的排出,在过去20多年的基础研究和工业制造上,这两种方案被广泛采用,并且继续指导着抗菌药物的未来研发和应用｡

3.2.1 增加抗生素的摄入 提高药物的摄入有多种方法,其中之一就是将抗生素与细菌ABC家族摄入蛋白的天然底物连接起来｡针对蛋白摄入系统设计的药物早已有报道[22]｡这个方法对原核生物有较高的特异性,因为设计时不得不遵循一个有趣的限制:设计的复合物的大小必须在摄入蛋白的转运能力范围之内[23]｡尽管如此,这个创意提出了一个极具潜力的解决办法｡因为ABC摄入蛋白对原核细胞具有特异性,并且这些蛋白的三维结构最近已经被确定,基于这些有利条件,针对ABC摄入系统开发的抗菌药物将在未来具有广阔前景｡

3.2.2 降低抗生素的外排 近年来有两个方法被尝试减少或者消除外排泵的泵出抗生素能力｡

3.2.2.1 具有生物活性的外排抑制剂 具有生物活性的外排抑制剂能够影响外排基因的表达,在这种情况下,外泵促进剂与抑制剂能够作为研究外泵蛋白生物活性的有效工具,并且能够为耐药的问题提供潜在的方案[24]｡尽管如此,这个方法也有明显的局限性,因为具有调节功能的分子通常不仅仅作用于一个基因靶点,所以很可能会产生不可预期的结果｡

3.2.2.2 具有药理活性的外排抑制剂 药理活性抑制剂可能通过非特异性和特异性的途径发挥作用,包括以下3个方面:①削弱能量和转运(仅限于间接的转运蛋白,ABC蛋白家族依赖消耗ATP的主动运输);②干扰外排泵活性(仅可能限于革兰氏阴性菌和ABC蛋白家族,如MacAB-TolC);③能够竞争性或者非竞争性的作用于外泵蛋白｡最后一点是在药物化学研发中采用最广泛的途径,并且许多高效的外泵抑制剂的化学结构已经被确证[25]｡

在真核细胞多药耐药性问题中,外泵抑制剂被广泛研究,尽管在临床上只有环孢菌素付诸应用｡因为真核细胞中的P-gp基因与一些细菌中的ABC家族蛋白如LmrA有高度同源性,所以研究中发现有些分子能够同时抑制真核细胞和原核细胞的外泵蛋白活性｡例如,作为用真核细胞的外排泵抑制剂实验模型的工具药维拉帕米,以及作为原核细胞的外排泵抑制剂实验模型的工具药利血平,二者均能够抑制两种外排泵的活性｡所以,由天然产物寻找或者化学途径合成ABC家族外泵抑制剂面临着一个重要的挑战:为避免副作用,必须寻找对原核细胞具有特异性的化合物｡现在,凭借一些转运蛋白的三维结构模型,这些问题有希望被解决｡所以,当前最多的精力集中在那些间接转运蛋白的研究,比如MFS(NorA),SMR(Em-rE),MATE(NorM),或者RND(MexAB-OprM),证实考虑到这些蛋白及其结构是细菌所特有的｡

综上,为了达到克服细菌外排作用引起的耐药性,需要收集和整合更多的外泵系统的三维结构,药理功能,基因编码和上下游调控蛋白的数据资料,并且针对来源于植物和化学合成的化合物进行基于细胞水平的大量筛选｡同时,将主要的药物设计靶点,尤其是摄入系统的靶点,选为ABC家族转运蛋白,对未来发现新的高效低毒且具有特异性的耐药抑制剂有着光明前景｡

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(收稿日期:2015-09-07)

通讯作者:司维,E-mail:35674214@qq.com｡

【中图分类号】Q 51

doi:10.3969/j.issn.1004-437X.2016.01.036