非小细胞肺癌组织中miR-219和环氧合酶-2表达水平联合预测新辅助化疗患者预后的价值

林海永，李世嘉，黄为福

(平南县第二人民医院肿瘤科，广西 贵港 537307)

非小细胞肺癌组织中miR-219和环氧合酶-2表达水平联合预测新辅助化疗患者预后的价值

林海永，李世嘉，黄为福

(平南县第二人民医院肿瘤科，广西 贵港 537307)

目的 探讨非小细胞肺癌(NSCLC)组织中微小核糖核苷酸-219(miR-219)和环氧合酶-2(COX-2)表达水平联合预测新辅助化疗患者预后的价值。方法采用免疫组化法检测2009年1月至2012年1月期间我院应用纤维支气管镜活检所得的85例NSCLC组织(NSCLC组)、30例肺部良性病变组织(良性组)和30例正常肺组织（正常组)中miR-219和COX-2蛋白的表达水平。统计NSCLC组患者无疾病进展生存期(3年生存率)，比较不同miR-219和COX-2蛋白患者的3年生存率，分析NSCLC组织中miR-219和COX-2蛋白水平与其3年生存率的关系及两者联合预测新辅助化疗患者预后的价值。结果NSCLC组miR-219蛋白阳性表达率为48.24%，低于良性组和正常组的73.33%和80.00%，COX-2蛋白阳性水平为61.18%，高于良性组和正常组的20.00%和16.67%，差异均有统计学意义(P＜0.05)，而良性组和正常组中miR-219和COX-2蛋白阳性表达水平比较差异无统计学意义(P＞0.05)；NSCLC组患者3年生存率为44.71%，且miR-219蛋白阴性表达患者和COX-2蛋白阳性表达患者的3年生存率低于miR-219蛋白阳性表达患者和COX-2蛋白阴性表达患者(P＜0.05)。Spearman秩相关分析结果显示，miR-219蛋白阳性表达水平与NSCLC新辅助化疗患者3年生存率呈正相关(r=0.784，P＜0.05)；COX-2蛋白阳性表达率与NSCLC新辅助化疗患者3年生存率则呈负相关(r=-0.783，P＜0.05)。ROC曲线分析结果显示，NSCLC新辅助化疗患者miR-219和COX-2蛋白表达联合预测患者的预后的灵敏度、特异度、准确性、曲线下面积、阳性预测值和阴性预测值分别为97.37%、95.74%、96.47%、0.775、94.87%和97.83%。结论NSCLC新辅助化疗患者miR-219蛋白阳性表达率下降而COX-2蛋白阴性表达率上升，且两者联合预测患者预后的价值良好，miR-219和环氧合酶-2表达水平可能作为NSCLC新辅助化疗患者预后评估的参考指标。

非小细胞肺癌；微小核糖核苷酸-219；环氧合酶-2；新辅助化疗；预后

非小细胞肺癌的恶性程度高，病情进展快，对其进行有效的治疗十分重要。由于手术禁忌证、费用昂贵等问题，非小细胞肺癌的治疗目前以放化疗为主[1]。新辅助化疗是化疗方案的一种，可减小肿瘤体，预防肿瘤远处转移的发生和提高化疗局控率[2]。然而非小细胞肺癌患者的死亡率亦仍较高，患者预后较差。其早期预后评估和及时干预对其预后的改善具有重要意义。微小核苷酸219是微小RNA中的一种，2012年刘彦伟等[3]的研究表明其与人脑成胶质瘤密切相关，可通过多个靶点控制人脑成胶质瘤的进展。环氧合酶2已被证明与肿瘤血管生长、侵袭和转移密切相关的肿瘤相关因子[4]。因此微小核苷酸219(miR-219)和环氧合酶2(COX-2)均可能与非小细胞肺癌患者病情和预后相关。本研究通过检测非小细胞肺癌组织中miR-219和COX-2的表达水平，探讨两者联合预测采用新辅助化疗治疗患者预后的价值，旨在为非小细胞肺癌预后的评估和改善提供指导。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2011年1月至2015年1月期间我院应用纤维支气管镜活检所得的85例NSCLC组织(NSCLC组)、30例肺部良性病变组织(良性组)和30例正常肺组织(正常组)。纳入标准：NSCLC组和良性组均经细胞学或组织学检查证实，取样前均未经放化疗等治疗，三组资料齐全且所有受检者均对实验知情同意。排除标准：排除合并小细胞肺癌或其他恶性肿瘤患者、伴严重肝肾心脏严重功能损伤患者或不同意参与者。85例NSCLC患者中男性58例，女性27例；年龄28～78岁，平均(49.68±8.78)岁。良性组患者中男性20例，女性10例，年龄25～76岁，平均(49.12±8.49)岁。正常组中男性21例，女性9例，年龄25～79岁，平均(49.47±7.95)岁。NSCLC组、良性组和正常组的性别、年龄等基本资料比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 治疗方法 NSCLC组均采用新辅助化疗治疗，具体方案为培美曲塞(500 mg/m2，dl)联合顺铂(75 mg/m2，dl)，将培美曲塞500 g采用0.9%的氯化钠注射液稀释为100 mL后静脉滴注，静脉滴注时间需为10 min以上，同时将顺铂溶于250 mL 5%葡萄糖溶液中并行静脉滴注，每天尿量低于2 000 mL的患者加用甘露醇利尿，21 d/次，共化疗两个疗程。化疗期间患者无中性粒细胞减少，5例患者出现血小板减少，85例患者出现尚可耐受的恶心、呕吐、头晕等胃肠道反应。化疗后均随访3年。

1.3 检测方法 采用免疫组化法检测NSCLC组、良性组和正常组标本中miR-219和COX-2蛋白的表达水平，具体如下：①三组标本均为纤维支气管镜活检所得标本，并于取样后经10%的中性福尔马林固定、石蜡包埋；②采用德国Leica PM2135切片机将标本切成4µm的连续切片，二甲苯脱蜡，100%、95%、90%、85%、80%、75%不同浓度的酒精行梯度脱水，采用预先配备的PBS液冲洗3次，5 min/次；③枸缘酸液行高压抗原修复，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，5 min/次。④添加3%过氧化氢溶液并于室温中孵育15 min以消除内源性过氧化物酶活性，PBS液冲洗3次，5 min/次；⑤pH 9.0 EDTA修复液修复，冷却至室温，PBS液冲洗3次，5 min/次；⑥除去PBS液体，添加聚合物增强剂，添加山羊血清，室温孵育20 min，去血清分别加入一滴一抗，4℃环境中过夜，PBS液冲洗3次，5 min/次；⑦每张切片滴加一滴二抗，室温孵育30 min，PBS液冲洗3次，5 min/次；⑧每张切片均滴加新鲜配备的DAB显色并于显微镜下观察显色，显色满意后采用自来水冲洗；⑨行苏木精复染，再次行梯度酒精脱水(同②)、二甲苯透明后封片。统计随访期间NSCLC组患者的生存情况并计算3年生存率。

1.4 染色评价[5]COX-2表达于细胞浆或细胞膜，miR-219表达于细胞膜，以出现黄色或棕黄色颗粒为阳性。随机选取10个高倍视野观察染色超范围及着色程度，根据观察结果分为：无阳性着色为阴性(-)，出现黄色或棕黄色颗粒细胞低于10%为弱阳性(+)，出现黄色或棕黄色颗粒细胞低于10%～30%为中度阳性(++)，出现黄色或棕黄色颗粒细胞低于30%～100%为强阳性(+++)，阳性表达率=(弱阳性例数+中度阳性例数+强阳性例数)/总例数×100%。

1.5 统计学方法 应用SPSS19.0统计学软件进行数据分析，计数资料以百分比表示，组间比较采用χ2检验，计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用t检验，相关性分析采用Spearman秩相关分析法，采用受试者操作特性曲线(ROC)分析NSCLC新辅助化疗患者miR-219和COX-2蛋白表达情况联合预测其预后情况的价值，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 三组受检者的miR-219和COX-2蛋白阳性表达率比较 良性组和正常组中miR-219和COX-2蛋白阳性表达水平比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。NSCLC组miR-219蛋白阳性表达率低于良性组和正常组，COX-2蛋白阳性水平则高于良性组和正常组，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 三组受检者的miR-219和COX-2蛋白阳性表达比较[例（%）]

2.2 NSCLC组及不同miR-219和COX-2蛋白表达患者的3年生存率比较 85例NSCLC组患者中3年存活者 38例，3年存活率为44.71%(38/85)。miR-219蛋白阴性表达患者的3年生存率为34.09% (15/44)，低于miR-219蛋白阳性表达患者的56.10% (23/41)，差异有统计学意义(χ2=4.158，P＜0.05)；COX-2蛋白阳性表达患者3年生存率为30.77%(16/52)，低于COX-2蛋白阴性表达患者的66.67%(22/33)，差异有统计学意义(χ2=10.524，P＜0.05)。

2.3 miR-219和COX-2蛋白表达与NSCLC新辅助化疗患者3年生存率的关系 Spearman秩相关分析结果显示，NSCLC新辅助化疗患者miR-219蛋白阳性表达患者的3年生存率较长，miR-219蛋白阳性表达水平与NSCLC新辅助化疗患者3年生存率呈正相关(r=0.784，P＜0.05)；NSCLC新辅助化疗患者COX-2蛋白阳性阳性表达患者的3年生存率较短，COX-2蛋白阳性表达率与NSCLC新辅助化疗患者3年生存率则呈负相关(r=-0.783，P＜0.05)。

2.4 miR-219和COX-2蛋白表达联合预测NSCLC新辅助化疗患者预后的价值 ROC曲线分析结果显示，NSCLC新辅助化疗患者miR-219和COX-2蛋白阳性表达率联合预测其预后情况的价值良好，其灵敏度、特异度、准确性、曲线下面积、阳性预测值和阴性预测值分别为97.37%、95.74%、96.47%、0.775、94.87%和97.83%，见图1。

图1 NSCLC新辅助化疗患者miR-219和COX-2蛋白表达联合预测其3年生存率的ROC曲线

3 讨论

肺癌是最常见的恶性肿瘤，其病情发展快，复发转移率和死亡率高，患者预后极差，是我国城市人口恶性肿瘤死亡的首要原因，且已成为全世界范围内严重威胁人类健康和生命安全的呼吸系统恶性肿瘤疾病[6-7]。肺癌中超过80%为非小细胞肺癌[8]。非小细胞肺癌的治疗方法目前主要有手术、放化疗、免疫疗法和中医中药疗法，其中手术治疗是肺癌最重要的治疗方法[9]。然而由于肺癌的手术疗法局限性较大且其复发转移率高，放化疗等综合治疗在肺癌治疗中越来越受到重视。新辅助化疗目前已在多个临床研究中取得了良好的效果，对提高患者生存率和改善患者生存质量等方面均具有重要价值，且无手术的难度和风险[10]。新辅助化疗受到越来越多的人们的重视，然而仍存在部分肺癌患者生存期短，预后情况差。因此对肺癌患者的预后预测和早期干预亦十分重要。在肿瘤的发生和发展中，DNA异常甲基化可导致微小RNA等抑癌基因的失活和癌基因的激活[11]。因此miR-219可能与非小细胞肺癌病情和预后相关。COX-2又称前列腺素过氧化物合成酶，是膜结合型蛋白，可参与炎症和肿瘤的发生发展，是快速反应基因[12]。因此COX-2亦可能与非小细胞肺癌患者的病情和预后相关。然而目前关于COX-2和miR-219两者联合预测非小细胞肺癌患者预后的研究较少。

本研究结果显示，非小细胞肺癌组织中miR-219蛋白的阳性表达率较低，明显低于肺良性病变患者和健康患者，提示miR-219与非小细胞肺癌可能相关。非小细胞肺癌组织中COX-2的阳性表达率较高，明显高于肺良性病变患者和健康患者，提示COX-2亦可能与非小细胞肺癌相关。非小细胞肺癌行新辅助化疗患者的3年生存率不足50%，患者预后情况差，其预后的早期预测和干预亦改善预后情况十分重要。非小细胞肺癌组织中miR-219蛋白阴性表达的行新辅助化疗患者的3年生存率高于阳性表达患者，提示miR-219可能与非小细胞肺癌行新辅助化疗患者的预后相关，这与miR-219可能与非小细胞肺癌病情和预后相关的假设一致。进一步Spearman秩相关分析结果显示，NSCLC新辅助化疗患者miR-219蛋白阳性表达患者的3年生存率高，miR-219蛋白阳性表达水平与NSCLC新辅助化疗患者3年生存率呈正相关，进一步证实了非小细胞肺癌病情和预后相关的假设。非小细胞肺癌组织中COX-2阳性表达的新辅助化疗患者的3年生存率低于其阴性表达患者，这与COX-2亦可能与非小细胞肺癌患者的病情和预后情况相关的假设一致。进一步Spearman秩相关分析结果显示，NSCLC新辅助化疗患者COX-2蛋白阳性阳性表达患者的3年生存率较短，COX-2蛋白阳性表达率与NSCLC新辅助化疗患者3年生存率则呈负相关，进一步证实了COX-2可能与非小细胞肺癌患者的病情和预后情况相关的假设。其机制可能是miR-219可通过抑制癌基因的表达而起到抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移[13]，因此miR-219阴性表达患者肿瘤增殖、侵袭和转移受到抑制，患者预后情况良好，而COX-2调控其下游PEG2、VEGF、bcl-2等蛋白的表达而促进肿瘤细胞增殖和血管生成相关[14]，因此COX-2阴性表达患者的预后情况较差。ROC曲线分析结果显示miR-219和COX-2蛋白表达情况联合预测非小细胞肺癌行新辅助化疗患者3年生存率的灵敏度、特异度、准确性、阳性预测值和阴性预测值均达90%以上，miR-219和COX-2蛋白表达情况联合预测非小细胞肺癌行新辅助化疗患者预后情况的价值良好。出现miR-219阴性表达和COX-2蛋白阳性表达的非小细胞肺癌患者需警惕其不良预后的发生，改变治疗方法，可进一步采用综合治疗方法进行干预以改善患者的预后情况。

综上所述，非小细胞肺癌患者的miR-219蛋白阴性表达率和COX-2蛋白阳性表达率均较高且两者联合预测新辅助化疗患者预后的价值良好，可能用于非小细胞肺癌新辅助化疗患者预后的早期评估，从而为其预后的干预和改善提供依据。

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Value of combined detection of miR-219 and cyclooxygenase-2 in predicting prognosis of patients with non-small cell lung cancer treated with neoadjuvant chemotherapy.

LIN Hai-yong,LI Shi-jia,HUANG Wei-fu. Department of Oncology,the Second People's Hospital of Pingnan,Guigang 537307,Guangxi,CHINA

ObjectiveTo explore the value of tiny ribonucleotid-219(MiR-219)and cyclooxygenase-2 (COX-2)expression level in predicting prognosis of patients with non-small cell lung cancer(NSCLC)treated with neoadjuvant chemotherapy.MethodsEighty-five NSCLC tissue samples(NSCLC group),30 lung benign lesion tissue samples(benign group)and 30 normal lung tissue samples(normal group)were obtained by fiberoptic bronchoscopy in our hospital from January 2009 to January 2012,and miR-219 and the COX-2 protein expression level of the three groups were detected by immunohistochemical method.The 3-year survival rates of NSCLC group were statistically analyzed,and the 3-year survival rates of patients with different levels of miR-219 and COX-2 protein were compared. Relationship between miR-219,COX-2 protein expression levels in NSCLC tissue samples and its 3-year survival rate were analyzed.The value of miR-219 and COX-2 protein expression levels in predicting prognosis of NSCLC patients treated with neoadjuvant chemotherapy were also analyzed.ResultsThe positive expression rate of miR-219 proteinin NSCLC group was 48.24%,which was significantly lower than 73.33%of benign group and 80.00%of normal group, while positive expression rate of COX-2 protein(61.18%)was significantly higher than that of benign group and normal group(20.00%and 16.67%),with statistically significant differences(P＜0.05).The positive expression level of miR-219 and COX-2 protein had no statistically significant difference between benign group and normal group(P＞0.05).The 3-year survival rate of NSCLC group was 44.71%,and the patients with negative expression of miR-219 and those with positive expression of COX-2 protein had lower 3-year survival rate than the patients with positive expression of miR-219 and negative expression of COX-2 protein(P＜0.05).Spearman rank correlation analysis showed that positive expression level of miR-219 protein and 3-year survival rates of NSCLC patients treated with neoadjuvant chemotherapy were positively correlated(r=0.784,P＜0.05),while positive expression rate of COX-2 protein and 3-year survival rates of NSCLC patients treated with neoadjuvant chemotherapy were negatively correlated(r=-0.783,P＜0.05).ROC curve analysis showed that the sensitivity,specificity,accuracy,area under the curve,positive predictive value and negative predictive value of miR-219 and COX-2 protein expression levels in predicting prognosis of NSCLC patients treated with neoadjuvant chemotherapy were 97.37%,95.74%,96.47%,0.775,94.87%and 97.83% respectively.ConclusionNSCLC patients treated with neoadjuvant chemotherapy had lower miR-219 protein positive expression rate and higher COX-2 protein negative expression rate,and combined detection of miR-219 and COX-2 protein negative has high value in predicting prognosis of NSCLC patients treated with neoadjuvant chemotherapy.The expression levels of miR-219 and COX-2 may be taken as reference index for evaluating the prognosis of NSCLC patients treated with neoadjuvant chemotherapy.

Non-small cell lung cancer;Tiny ribonucleotid-219;Cyclooxygenase 2;Neoadjuvant chemotherapy;Prognosis

R734.2

A

1003—6350（2016）20—3289—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.20.007

2016-03-31)

广西贵港市科学研究与技术开发计划项目（编号：1408020）

林海永。E-mail：1966244336@qq.com