兽用狂犬病疫苗的发展

马晓莉　徐铮　刘忠华　陈嘉　余文兰　华南农业大学　510642

兽用狂犬病疫苗的发展

马晓莉徐铮刘忠华陈嘉余文兰华南农业大学510642

狂犬病病毒只有一种血清型，世界各地的狂犬病毒抗原性质是相同的。当前大部分国家所用的兽用狂犬病疫苗主要有三种，即弱毒苗、灭活疫苗和基因工程疫苗。当前我国兽用的有灭活苗和弱毒苗两种，但是随着生物和分子生物学技术的发展，新型狂犬病疫苗已经逐渐走进研究者的视野，例如多肽疫苗、基因工程疫苗、核酸疫苗、活载体疫苗及植物疫苗等。随着兽用狂犬病疫苗的发展迅速，科学家们对其的研究也越来越深入，相信在不久的将来，狂犬病会得到很好的控制。

兽用；狂犬病疫苗；发展

1　神经组织疫苗

最早制造狂犬病疫苗的是法国的巴斯德。1882年他成功地应用连续传代减弱病毒毒力的方法，用适应毒种来制造疫苗。早期的狂犬病疫苗是用成年山羊和绵羊神经组织经石炭酸或石炭酸和乙醚灭活后制成，用于犬的免疫。但免疫后不仅引起神经系统副反应，而且疫苗中残余的活毒能够引起狂犬病。1955年，Fuenja1ida和Pa1acios将狂犬病毒脑内接种3～5日龄的新生鼠，于接种后4天收集脑组织，制备了新生鼠脑疫苗。由于新生鼠脑神经组织中仅存在少量鞘磷脂，所以引发的副反应较少。在过去的40多年里，南美洲广泛使用此疫苗。由于神经组织疫苗注射量大，接种次数多（14针以上），抗体产生慢、水平低，含有神经麻痹因子，易引发变态反应，而且疫苗中易残留有感染性的活病毒，因此，WHO狂犬病专家委员会已提出尽快停止使用神经组织疫苗。

2　鸡胚疫苗

用鸡胚生产狂犬病疫苗的毒株主要是F1ury和Ke1ev株。F1ury株为1939年分离自死于狂犬病名叫F1ury的女孩，经1日龄雏鸡脑内传了138代减毒，随后又经鸡胚卵黄囊传40～50代，取名F1ury鸡胚株（F1ury LEP）。F1ury LEP对小白鼠、大白鼠和地鼠经脑内或肌肉途径感染均有致病性，对豚鼠脑内感染有致病性，肌肉感染则无致病力。F1ury LEP对家兔脑内或肌肉均无致病性，对犬肌肉注射也没有任何感染症状，但对猫和牛仍有致病性，因此认为LEP株对犬是安全的，被推荐仅供3月龄以上犬肌肉免疫用。LEP株进一步传代至138代称为LEP高代鸡胚株（F1uryHEP），其毒力进一步减弱，但对乳鼠脑内接种仍有致病性，被推荐用于犬、猫和牛的肌肉免疫。Ke1ev株为1950年分离自以色列的一只患狂犬病的犬经鸡胚传100代减毒，对地鼠、豚鼠和家兔肌肉和脑内接种均未感染。用高浓度病毒悬液肌肉接种犬未产生任何感染症状，用于制备疫苗的毒种为60～70代鸡胚株，已被推荐用于犬和牛的肌肉注射。

3　兽用弱毒口服疫苗

弱毒活疫苗是通过细胞培养生产，所用毒株主要包括 Street A1abama Dufferin（SAD）株、Eve1yn-Rokitnicki-Abe1seth（ERA）株及其他SAD株相关毒株。与灭活疫苗相比，弱毒活疫苗的生产成本低廉，主要是由于弱毒疫苗株RV能在动物体内增殖、合成病毒抗原，能以较少的病毒量诱导有效地保护性免疫反应，降低了狂犬病疫苗的生产成本，因而在亚洲、非洲和欧洲部分地区仍被使用。尽管弱毒活疫苗价格比灭活疫苗低廉，而且可以通过口服途径免疫接种，然而弱毒活疫苗存在一个致命缺陷：病毒在动物体内增殖时，其残留毒力或致病性突变有时会致使接种动物发病。世界卫生组织不推介弱毒活疫苗经非口服途径免疫接种动物，现在主要用于动物的口服免疫。因此，现在灭活疫苗比弱毒活疫苗的使用范围更为广泛。

4　基因工程疫苗

随着现代生物技术的发展和应用，人们开始研究狂犬病病毒重组活疫苗，目的在于保留狂犬病病毒有免疫原性的抗原部分，而不含狂犬病病毒的致病性，降低组织培养的生产成本。狂犬病病毒中可诱导中和抗体产生的抗原为糖蛋白（G），具有诱导细胞免疫的保护性抗原为核蛋白 （N）。近几年对狂犬病病毒G和N基因表达及免疫效果进行了研究，主要为口服免疫有效的重组体。1984年美国 Wistar研究所和法国Trangen合作研究，由Kieny等合成了一种新疫苗，用牛痘病毒加入狂犬病毒的糖蛋白抗原基因，称为VRG （Vaccinia Rabies G1ycoprotein）。VRG的主要步骤是先克隆G基因的cDNA，经修饰后拼接启动子及痘病毒的TK基因构成载体，再与感染痘病毒的细胞进行重组。再经空斑克隆3次纯化后，经Southemb1ot、免疫荧光、免疫印染等证实表达的糖蛋白分子量为66kD，与天然糖蛋白相同。可在Vero细胞系上培养。VRG口服疫苗于1987年10月24日在比利时进行投放，共投放了250个诱饵。对实验中心地区238个诱饵进行观察，在投放后94%的诱饵被吃掉。温度在-10～20℃的条件下，VRG保存 90天没有明显的滴度变化，只有在4个月时发生下降。由此可见VRG株VI服疫苗具备有效性、无毒性和热稳定性的特点。1989年加拿大Prevec等将狂犬病病毒ERA株的糖蛋白基因cDNA重组到人腺病毒5型基因组中，获得重组体HAd5RG，臭鼬口服HAd5RG后，保护率100%基因重组口服疫苗比现行活疫苗更安全、更便于生产，而且成本低，使用方便。

国内有研究在狂犬病毒弱毒株Hep-F1ury株全基因组3'-N-P-M-G-L-5'的伪基因区域（G与L之间），插入一个G基因，构建了携带双G基因的全长感染性克隆，其与辅助质粒共转染BHK-21细胞，成功获得狂犬病毒Hep-F1ury-dG嵌合病毒，盲传十代，用荧光抗体和RT-PCR鉴定，该嵌合病毒在BHK-21细胞中稳定生长。对其进行生物学特性研究，结果表明，Hep-F1ury-dG株和rHep-F1ury株比较，其致病性降低、免疫原性提高。国内研究者在广州市增城区某村进行狂犬病基因工程灭活疫苗（Hep-F1ury-dG株）环境释放试验，登记该村所有家养犬的信息并存档，同时进行疫苗免疫。随机采集免疫前血清样品66份，免疫后21天获得血清样品66份，使用ELISA方法检测样品的抗体水平。发现免疫前该村犬只抗体阳转率为26%，免疫后21天抗体阳转率达到83%。统计分析表明，免疫前后抗体水平差异具有统计学意义。由此得出结论，狂犬病基因工程灭活疫苗（Hep-F1ury-dG株）免疫犬只后可提供足够的保护力，有效保护犬只免受狂犬病病毒感染，因而预防狂犬病从犬-犬或犬-人的传播。为农村地区家养犬建立免疫档案，监控犬只抗体水平，使犬群间形成狂犬病抗体阳性率达到70%以上的坚强免疫带，是预防农村地区狂犬病发生的一种可行、有效的方法。

（1）基因重组减毒疫苗。20世纪80年代，狂犬病病毒糖蛋白基因克隆和测序不久后，便开始制备异源性重组狂犬病疫苗研究。狂犬病毒重组疫苗是指应用DNA重组技术，借助载体对狂犬病毒中的基因进行重组表达，表达产物或重组体本身用于研制疫苗。由于重组体只保留了狂犬病毒中具有免疫作用的基因，因此这种疫苗不具有发生狂犬病的潜在危险。重组疫苗的载体有大肠杆菌、痘苗病毒腺病毒、杆状病毒、犬疱疹病毒和非复制病毒载体等。有学者就曾通过基因敲除使RV的磷酸化蛋白基因缺失，构建重组RV活疫苗。这种疫苗与传统的减毒活苗相比，也可以诱导机体产生长时间的保护性抗体。但是基因重组减毒疫苗也存在着潜在的危险，比如基因突变的减毒活疫苗会与自然存在的野毒株发生重组，或者原本敲除的基因会重新发生基因修补，从而出现毒力增强的现象。

（2）核酸疫苗。也叫DNA疫苗，是将编码某种抗原蛋白的基因置于真核表达元件的控制之下，构成重组质粒DNA，将其直接导入动物机体内，通过宿主细胞的转录翻译系统合成抗原蛋白，从而诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答。基因疫苗能诱导产生细胞和体液免疫，能够刺激产生较强和较持久的免疫应答，可以将含有不同抗原基因的质粒混合起来进行联合免疫，能够反复使用，因此基因疫苗成为新型疫苗发展的热点。第一个报道的狂犬病核酸疫苗是携带和表达ERA株糖蛋白eDNA的重组质粒。1994年Wistar研究所Xiang ZQ等将编码狂犬病病毒糖蛋白的eDNA插入SV40启动子下游，构建狂犬病病毒的DNA疫苗，直接注射小鼠腓肠肌，免疫3次，间隔2～3周，150g/次。免疫后小鼠产生了抗狂犬病病毒中和抗体、抗狂犬病病毒糖蛋白特异性CTL和分泌淋巴因子的rrh细胞，用5倍LD50剂量的狂犬病病毒CVS株攻击，均获得保护，而对照组小鼠14天内全部死亡。Lodme11 D L等把带有G基因的DNA包被在2.6in金粒上，用基因枪免疫小鼠，初免及加强免疫后均可检测高滴度的抗体，并持续300天，315天后用致死量的狂犬病病毒攻击，小鼠全部存活。Ray N B等用单磷脂质A作为免疫刺激物，皮下免疫小鼠，可以提高DNA疫苗的免疫应答。国内扈荣良等首先将狂犬病病毒糖蛋白G基因插入PMTOIO/A+表达载体中，肌肉免疫小鼠后，能产生抗狂犬病病毒的抗体，对狂犬病病毒强毒攻击有一定的保护作用。李萍等将狂犬病病毒G基因重组到质粒PRC/CMV中，免疫小鼠可产生低滴度的中和抗体，对狂犬病病毒强毒攻击有一定的保护作用。基因疫苗虽然有众多优势，但是基因疫苗可能存在的安全性问题是外源基因导入体内后，可能与细胞染色体基因组发生整合，从而导致细胞转化和癌变，但迄今尚未发现有整合的证据。

捕杀流浪犬，加强家犬管理和强制接种狂犬病疫苗，预防家畜及野生动物的狂犬病是预防人感染狂犬病的重要措施，其任务涉及面广，需要全社会的配合、支持与理解。

［1］王健青，谢海燕，朱燕秋，东莞几种重要人畜共患病的调查分析［J］.黑龙江畜牧兽医，2014，02：67-68.

［2］张德礼，狂犬病疫苗的研究动向［J］.中国畜禽传染病，1994，6： 52-55.