长链非编码RNA与肿瘤关系研究进展

高荧苒，王大勇，李 涛，姬新颖

河南大学 医学院，河南 开封 475004



长链非编码RNA与肿瘤关系研究进展

河南大学 医学院，河南 开封 475004

长链非编码RNA(lncRNA)是长度在200～10 000 nt之间的不编码蛋白质的RNA分子，具有保守性低、组织特异性表达的特点。它参与细胞内多种过程的调控，对于哺乳动物的基因组和转录组以及转录和转录后基因表达的调控有着重要的影响。许多研究表明，lncRNA在许多不同类型的肿瘤中表达异常，探讨lncRNA与肿瘤发生发展的关系，可以使lncRNA成为肿瘤诊断的新的生物标志物和肿瘤治疗的潜在靶点。本文主要对lncRNA与食管癌关系的研究进行综述。

长链非编码RNA；肿瘤；食管癌；基因调控

长链非编码RNA(lncRNA)的表达异常与许多疾病密切相关，如认知障碍、心血管疾病、糖尿病和肿瘤等。lncRNA在多种类型的肿瘤中表达异常，它们的异常表达可能促进或抑制肿瘤的发生，如已经证实lncRNA在乳腺癌、肝癌、膀胱癌等肿瘤中异常表达。

然而关于lncRNA与食管癌的关系研究较少，本文对lncRNA与肿瘤的关系以及lncRNA在食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma)的研究进展进行综述。

1　乳腺癌与lncRNA

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。目前已经发现多种lncRNA与乳腺癌密切相关，如NBAT1、CCAT2、MALAT1等。

Hu[1]等基于癌症和肿瘤基因图谱(TCGA)，通过分析lncRNA数据库中NBAT1在lncRNA表达中的表达，发现与正常的组织相比，在癌组织中NBAT1表达被抑制，而且Kaplan-meier 生存分析表明NBAT1的低表达与不良的生存预后有关。为研究NBAT1在乳腺癌中的表达，比较乳腺上皮非致瘤性细胞系和乳腺癌细胞系中NBAT1不同入侵性的表达，相比乳腺上皮细胞系，在乳腺癌细胞中NBAT1的表达是下调的，而且NBAT1的表达与乳腺癌细胞系的入侵能力呈负相关，迁移能力较高的细胞株MDA-MB-231、MDA-MB-436、BT-549相对迁移能力较低的细胞株MCF7、T-470、ZR-75-1、BT-474、SK-BR-3、MDA-MB-453，NBAT1显著低表达。为了进一步研究NBAT1抑制乳腺癌细胞迁移和入侵的机制，通过微阵列分析来探讨NBAT1过表达的MDA-MB-231细胞系全基因表达的变化，发现NBAT1经由EZH2途径通过激活DKK1表达来抑制乳腺癌的迁移和入侵。这表明长链非编码RNA NBAT1是一个潜在的肿瘤抑制基因，是判断乳腺癌预后的一个潜在标记，也是抑制乳腺癌转移的一个潜在靶点。

Cai[2]等在最近的研究中首先通过实时定量PCR，测定67对食管癌组织与相邻正常组织中CCAT2的表达，证实在乳腺癌组织中CCAT2高表达，同样在食管癌细胞中CCAT2也高表达。进一步分析CCAT2表达和临床预后因素之间的关系，发现CCAT2高表达的患者预后明显较差，而且CCAT2相对表达水平与乳腺癌患者总体生存率相关。为了探索CCAT2在乳腺癌细胞中的生物功能，将CCAT2质粒转染入MCF-7和MDA-MB-231细胞系，通过MTT实验、transwell实验等发现抑制CCAT2的表达可以抑制体外乳腺癌细胞的增殖和入侵。然后，为了探索CCAT2在肿瘤发生中的作用，将转染NS质粒或CCAT2质粒的MCF-7细胞系混合基底膜基质注入裸鼠体内，两周后可以观察到明显的肿瘤，表明抑制CCAT2的表达可以抑制体内肿瘤的形成。最后还发现，CCAT2的异常表达会影响Wnt信号通路。因此，认为lncRNA CCAT2可能是一种参与乳腺癌发生发展的新的分子，它为乳腺癌提供了一个潜在的治疗靶点。

最近的研究表明，MALAT1在肿瘤的发生和发展中起着重要的作用。为了探索它在乳腺癌中是否也有类似的作用，Xu[3]等通过qPCR测定临床样本中MALAT1的表达，从乳腺癌患者中随机抽出的135个样本，发现相对于邻近的正常组织，乳腺癌组织中MALAT1表达下调，且乳腺癌细胞中MALAT1表达也下调。为了进一步研究MALAT1表达与乳腺癌特征之间的关系，在检测135个乳腺癌患者临床病理参数时检测MALAT1表达。统计分析表明，MALAT1表达下调与淋巴结的转移有密切的关系，生存分析表明MALAT1表达下调的乳腺癌患者生存率较低，即MALAT1在乳腺癌患者中的低表达与低的生存率有关。而且发现MALAT1表达下调，会促进乳腺癌细胞的迁移和入侵，乳腺癌细胞中的MALAT1下调可以通过磷脂酰肌醇-3-激酶信号通路诱导EMT进程。因此，考虑到MALAT1下调的乳腺癌患者的不良预后，发现MALAT1作为乳腺癌中EMT的调控因素，可能是有效治疗乳腺癌转移的潜在目标。

2　膀胱癌与lncRNA

一些lncRNA在膀胱癌的发生和发展中发挥至关重要的作用。Xue[4]等为了研究lncRNA-UCA1是否通过诱导EMT来调节食管癌细胞的迁移和入侵，首先建立了在食管癌UMUC2细胞系中转染pcDNA 3.1或pcDNA 3.1-UCA1质粒后，能稳定表达lncRNA-UCA1的模型，并通过实时定量PCR证实了lncRNA-UCA1的异常过表达；然后观察转染pcDNA 3.1或pcDNA 3.1-UCA1质粒的UMUC2细胞系的表型变化，又经过免疫荧光分析，发现lncRNA-UCA1过表达可以减少细胞膜上钙粘蛋白的表达，并增加波形蛋白的表达。结果表明，lncRNA-UCA1在膀胱癌细胞中发挥了诱导EMT的作用。与对照组相比，UMUC2细胞系中lncRNA-UCA1的过表达可以增加细胞的流动性，降低入侵的可能。这表明lncRNA-UCA1在调节膀胱癌细胞的迁移和入侵中起着重要的作用，lncRNA-UCA1通过hsa-miR-145-FSCN1通路调节膀胱癌细胞的迁移和入侵，lncRNA-UCA1和hsa-miR-145的表达呈负相关。因此，lncRNA-UCA1可能作为一种很有前途的目标来治疗膀胱癌的入侵和转移。

研究证实，GAS5可以控制细胞凋亡，而它在乳腺癌中表达下调。Liu[5]等为了研究GAS5是否参与调节膀胱肿瘤的发生，首先检测了膀胱癌组织与邻近正常组织的GAS5的表达水平，发现在膀胱癌细胞和组织中GAS5的表达普遍下调，而且下调膀胱癌中GAS5的表达会导致膀胱癌细胞的增殖；又通过蛋白质体外结合实验、RNA免疫共沉淀实验等发现GAS5能够通过CDK6调节膀胱癌细胞周期，敲除GAS5可以增加膀胱癌细胞中CDK6在mRNA和蛋白质水平的表达，GAS5下调导致G0/G1期细胞显著降低，S期细胞显著增加。通过功能的获得和丧失实验表明，在某种程度上，GAS5通过调节CDK6的表达来抑制膀胱癌细胞的增殖。

Chen[6]等在最近的研究中，首先采用层次聚类分析，比较膀胱癌组织和邻近正常组织中lncRNA的表达差异，发现有3种lncRNA在膀胱癌组织中表达上调，35种表达下调，其中lncRNA-n336928上调最显著，因此集中研究lncRNA-n336928；随后，用实时定量PCR测定了95例膀胱癌患者的组织样本以及邻近的非病变组织。结果表明，与相邻的非癌变组织相比，在膀胱癌组织中lncRNA-n336928的表达水平明显升高。随后又研究了lncRNA-n336928表达与临床病理参数之间的关系，经卡方检验，lncRNA-n336928表达与肿瘤阶段和等级呈正相关。Kaplan-Meier生存分析表明，lncRNA-n336928高表达的膀胱癌患者的总体存活率低于lncRNA-n336928低表达的患者。因此，lncRNA-n336928可能作为膀胱癌预后的生物标志物。

Han[7]等采用实时定量PCR测定了27位膀胱泌尿上皮肿瘤患者的肿瘤组织与邻近正常组织中hsa-miR-125b、SIRT7和MALAT1的表达，发现在膀胱癌组织中hsa-miR-125b表达下调，SIRT7和MALAT1的表达上调。分析发现，与肿瘤发生的低级阶段相比，高级阶段的SIRT7和MALAT1的表达水平较高，hsa-miR-125b表达水平较低，而且hsa-miR-125b调控SIRT7和MALAT1的表达。经计算机模拟分析，发现SIRT7和lncRNA-MALAT1可以作为预测hsa-miR-125b的目标。SIRT7是哺乳动物去乙酰化组蛋白家族的成员，在乳腺癌组织中表达上调，MALAT1在很多癌症中也是过表达，之前确定MALAT1在膀胱癌中表达上调，扮演了致癌角色。因此，hsa-miR-125b通过下调致癌基因SIRT7和致癌性lncRNA-MALAT1的表达来抑制膀胱癌的发展。

3　食管癌与lncRNA

食管癌作为世界上第八位最常见癌症，在全部恶性肿瘤死亡回顾调查中仅次于胃癌而居第二位。现在主要的治疗方法有手术、放疗或化疗，但是治疗水平和预后依然很差。早期的诊断是关键，但是由于食管癌早期缺乏典型的症状和足够灵敏特定的生物标志物，所以很难在早期诊断出来。因此，需要寻找在食管癌发生早期的生物标志物，来降低食管癌的死亡率。最近的研究显示，lncRNA在食管癌的发生中扮演重要的角色，对这些lncRNA进行干预会成为食管癌早期诊断和治疗的靶点。

Xu[8]等对62例食管癌患者运用实时定量PCR分析，将食管癌组织与邻近正常组织相比，发现TUG1高表达，平均高4.84倍；然后探讨TUG1的表达与临床病理参数之间的关系，发现TUG1的表达与家族史密切相关。为了研究TUG1的生物学功能，在体外设计了两种SiRNA来抑制TUG1，向两种高表达TUG1的TE-13和KYSE-410细胞系中转染si-TUG1或NC，经36 h培养，TUG1表达显著下降。CCK8检测表明敲除TUG1可以显著抑制TE-13和KYSE-410细胞系的增殖。接下来的细胞流式分析则进一步验证TUG1是否可以通过改变细胞周期和细胞凋亡过程来影响食管癌细胞的增殖，结果显示SiRNA可以阻滞TE-13和KYSE-410的S期，但沉默TUG1并不影响细胞凋亡。细胞划痕实验显示下调TUG1显著降低TE-13和KYSE-410细胞系的迁移能力。而且transwell实验表明与正常对照相比，SiRNA可以显著降低迁移能力。可知，TUG1促进食管癌细胞的增殖和迁移，是一个潜在的致癌基因。

Wang[9]等通过qRT-PCR测量73对食管癌患者病变组织与临近正常组织中PlncRNA-1的表达。结果表明，在69.8%的食管癌患者的癌变组织中PlncRNA-1的表达显著上调，PlncRNA-1表达的平均值为7.562。依据平均值把食管癌患者分为两组：一组的PlncRNA-1表达率小于平均值，一组的PlncRNA-1表达率大于平均值。然后，分析食管癌患者的临床病理信息与PlncRNA-1表达之间的关系，与肿瘤仅在食管局部相比，肿瘤扩散到淋巴结的PlncRNA-1的表达显著提高，而且临床病理阶段III、IV期的PlncRNA-1的表达明显高于I、II期。为了研究PlncRNA-1在食管癌中的作用，采用实时定量PCR测量7种食管癌细胞系和1个良性食管上皮细胞系中PlncRNA-1的表达水平，发现7种癌细胞系中PlncRNA-1的表达均高于Het1A细胞系，其中KYSE180中PlncRNA-1表达最高。所以，将KYSE180细胞系用于接下来的研究，通过平板克隆实验发现敲除KYSE180细胞系的PlncRNA-1细胞增殖明显受到抑制，因此下调PlncRNA-1的表达可以抑制食管癌细胞的增殖。

Tong[10]等首先筛选出GAPDH作为分析食管癌组织中lncRNA的最佳内参，测定了270例血浆样本中GAPDH的表达。结果显示，GAPDH的水平稳定，不受年龄、性别和病变的影响。然后，通过实时定量PCR检测48对食管癌组织和邻近正常组织中10种lncRNA的表达，包括HOTAIR、AFAP1-AS1、POU3F3、HNF1A-AS1、PlncRNA1、SPRY4-IT1、ENST00000435885.1、ENST00000547963.1、91H 和XLOC_013104。结果表明，除91H 和XLOC_013104外，其余lncRNA均在食管癌组织中表达显著提高。为了探讨这些与食管癌相关的lncRNA是否进入循环系统可以被检测到，采用实时定量PCR检测48个血浆样本中这8种lncRNA的表达。结果发现，POU3F3、HNF1A-AS1、SPRY4-IT1在食管癌患者中的表达显著高于正常对照组。为了进一步确定这些lncRNA是否存在于血浆中，将qPCR产物采用传统的Sanger测序法测序，如预期一样，测得的序列与从POU3F3、HNF1A-AS1、SPRY4-IT1中得到的相同。接下来，又检测了这三种与食管癌相关的lncRNA在血浆中存在的稳定性，比较了血浆和血清中lncRNA的表达，结果表明评估血浆和血清中的lncRNA的表达都可以作为肿瘤生物标志物。为了进一步确定食管癌患者血浆中这三种lncRNA表达水平是否与临床病理参数有关，测量147例食管癌患者的POU3F3、HNF1A-AS1、SPRY4-IT1的表达水平，发现血浆中这三种lncRNA表达水平与临床病理参数没有明显关系。147例食管癌患者和123名健康者的ROC曲线以及AUC显示，在食管癌患者和健康人群中ROC曲线明显不同，POU3F3的AUC为0.842，HNF1A-AS1的为0.781，SPRY4-IT1的为0.800，与标准的肿瘤标志SCCA的AUC 0.784相比，血浆中POU3F3的表达水平可以将食管癌与正常对照组区分开来。

Wang[11]等为了验证MALAT1是否受miRNA的调控，首先敲除Ago2和内切酶来测量食管癌细胞中MALAT1表达的变化，发现KYSE30、KYSE150和KYSE450细胞系中MALAT1的表达升高了1.2～1.5倍。结果表明，miRNA参与了MALAT1的调控。而且发现miR-101和miR-217都呈时间和浓度依赖性抑制细胞增殖，证实了MALAT1的转录后沉默是通过miR-101和miR-217阻滞G2/M细胞周期来抑制食管癌细胞的增殖。还发现通过过表达miR-101、miR-217或MALAT1siRNA可以抑制食管癌细胞的迁移和入侵能力，这可能是由于MALAT1下游基因的异常表达，如MIA2、HNF4G、ROBO1、CCT4和CTHRC1。通过比较42对食管癌组织样本和邻近正常组织，发现miR-101或miR-217与MALAT1存在显著的负相关。异种移植小鼠实验数据也证实miR-101和miR-217在食管癌中的肿瘤抑制作用。因此说明，在食管癌的发生发展中，miRNAs与lncRNA是相互作用的，了解lncRNA与肿瘤发生发展的关系，可能成为恶性肿瘤诊断、预后判断的新的分子标记以及改善肿瘤治疗效果的分子靶标。

[1] Hu P, Chu J, Wu Y, et al. NBAT1 suppresses breast cancer metastasis by regulating DKK1 via PRC2[J]. Oncotarget, 2014,6(32):32410.

[2] Cai Y, He J, Zhang D. Long noncoding RNACCAT2 promotes breast tumor growth by regulating the Wnt signaling pathway[J]. OncoTargets and Therapy, 2015,8:2657-2664.

[3] Xu S, Sui S, Zhang J, et al. Downregulation of long noncoding RNA MALAT1 induces epithelial-to-mesenchymal transition via the PI3K-AKT pathway in breast cancer[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015,8:4881-4891.

[4] Xue M, Pang H, Li X, et al. Long non-coding RNA urothelial cancer-associated 1 promotes bladder cancer cell migration and invasion by way of the hsa-miR-145-ZEB1/2-FSCN1 pathway[J]. Cancer Science, 2015,6:1-10.

[5] Liu Z, Wang W, Jiang J, et al. Downregulation of GAS5 promotes bladder cancer cell proliferation, partly by regulating CDK6[J]. Plos one, 2013,8:1-8.

[6] Chen T, Xie W, Xie L, et al. Expression of long noncoding RNA lncRNA-n336928 is correlated with tumor stage and grade and overall survival in bladder cancer[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2015,468:666-670.

[7] Han Y, Liu Y, Zhang H, et al. Hsa-miR-125b suppresses bladder cancer development by down-regulating oncogene SIRT7 and oncogenic long non-coding RNA MALAT1[J]. FEBS Letters, 2013,587:3875-3882.

[8] Xu Y, Wang J, Qiu M, et al. Upregulation of the long noncoding RNA TUG1 promotes proliferation and migration of esophageal squamous cell carcinoma[J]. Tumour Biol, 2015,36:1643-1651.

[9] Wang C, Wu Q, Li S, et al. Upregulation of the Long Non-coding RNA PlncRNA-1 Promote Esophageal Squamous Carcinoma Cell Proliferation and Correlates with Advanced Clinical Stage[J]. Dig Dis Sci, 2014,59:591-597.

[10] Tong Y, Wang X, Zhou X, et al. Identification of the long non-coding RNA POU3F3 in plasma as a novel biomarker for diagnosis of esophageal squamous cell carcinoma[J]. Molecular Cance, 2015,14:1-13.

[11] Wang X, Li M, Wang Z, et al. Silencing of Long Nonco-ding RNA MALAT1 by miR-101 and miR-217 Inhibits Proliferation, Migration, and Invasion of Esophageal Squamous Cell Carcinoma Cells[J]. The Journal of Biological Chemistry, 2015,290:3925-3935.

[责任编辑李麦产]

Research progress on the relationship between lncRNA and tumor

College of Medicine, Henan University, Henan Kaifeng 475004, China

Long chain non coding RNA (lncRNA) is a RNA molecule that does not encode protein between the length of 200-10000nt. It has the characteristics of low conservation and tissue specific expression. It participates in the regulation of many processes in the cell, and lncRNA has important influence on the regulation of the mammalian genome and transcription group, as well as the regulation of gene expression after transcription and transcription. Many studies show that lncRNA in many different types of tumors is the abnormal expression, and to investigate the relationship between the lncRNA and tumor development can make the lncrna marks a potential target and tumor therapy for tumor diagnosis of new biological. In this paper, the research on the relationship between lncRNA and esophageal cancer is reviewed.

long chain non coding RNA; tumor; esophageal cancer; gene regulation

1672-7606(2016)03-0221-04

2016-05-28

国家自然科学基金面上项目(81470545，81670088)

高荧苒(1992-)，女，河南安阳人，在读研究生，从事精准医学和医学免疫学研究工作。

姬新颖(1963-)，男，河南新安人，河南大学医学院教授，从事细胞免疫研究与治疗工作。

R730

A