异源淋巴细胞免疫治疗后反复妊娠丢失患者的外周血NK细胞变化

范格英，林芸，汤小湄，赵杨，苗竹林

(1.广东省人民医院广东省医学科学院妇产科，广东广州510080；2.暨南大学第一附属医院妇产科，广东广州510632；3.广东省计划生育专科医院广东省计划生育科学技术研究所生殖中心，广东广州510600)

异源淋巴细胞免疫治疗后反复妊娠丢失患者的外周血NK细胞变化

范格英1，林芸1，汤小湄2，赵杨1，苗竹林3

(1.广东省人民医院广东省医学科学院妇产科，广东广州510080；2.暨南大学第一附属医院妇产科，广东广州510632；3.广东省计划生育专科医院广东省计划生育科学技术研究所生殖中心，广东广州510600)

目的观察异源淋巴细胞免疫治疗后反复妊娠丢失(RPL)患者的外周血自然杀伤(NK)细胞变化情况。方法选取2012年1月至2013年12月期间在我院门诊就诊的反复妊娠丢失并具备免疫治疗适应证的患者30例(RPL组)，采用流式细胞术分析异源淋巴细胞免疫治疗后其外周血NK细胞及亚群的变化，并以26例正常妇女做为健康对照组进行比较。结果异源淋巴细胞主动免疫治疗前，RPL组患者外周血CD3-CD56+NK细胞比例明显高于健康对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)，而其余亚群比例CD3+CD56+、CD56dimCD16+、CD56brightCD16-、CD56+CD69+比较则差异均无统计学意义(P＞0.05)；经过治疗后，患者外周血CD3-CD56+NK细胞比例从治疗前的(17.07±8.19)降为治疗后的(10.02±7.32)，差异有统计学意义(P＜0.05)，而其余亚群比例治疗前后比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。结论异源淋巴细胞免疫治疗可能通过降低CD3-CD56+NK细胞比例促进再次妊娠的成功。

异源淋巴细胞免疫治疗；NK细胞；反复妊娠丢失

近年来，妊娠丢失成为困扰人们的主要难题，尤其是不明原因的反复妊娠丢失，严重影响女性身心健康。目前研究认为妊娠犹如半同种异体移植，妊娠妇女对胚胎父系同种抗原呈低识别或低反应性，容易导致妊娠丢失的发生，通过免疫治疗可使患者的妊娠丢失率得到有效的控制，并取得了较好的疗效，但其作用机制尚不明了。笔者采用淋巴细胞免疫(Lymphocyte immunotherapy，LIT)治疗反复妊娠丢失(Recurrent pregnancy loss，RPL)患者，观察其治疗后的外周血自然杀伤细胞(Natural killer cell，NK)亚群变化，探讨有效的反复妊娠丢失治疗手段，从而避免妊娠丢失的再次发生，减少患者的痛苦。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2012年1月至2013年12月期间在我院门诊就诊且自然流产两次及两次以上的反复妊娠丢失患者30例(RPL组)采用异源淋巴细胞免疫治疗，所有入组患者均有生育要求，封闭抗体检测阴性，工作及生活环境无污染[3]。排除导致妊娠丢失有关的遗传因素、解剖学因素、内分泌功能紊乱、感染以及其他免疫性疾病；排除男方不育因素(要求配偶精液检查正常，染色体核型分析无异常)。同时选取26例无不良妊娠史的正常体检妇女作为健康对照组。

1.2 异源淋巴细胞免疫治疗方法清晨少量进食，抽取配偶或第三方供血者抗凝静脉血20 ml，无菌条件下用淋巴细胞分离液分离得到淋巴细胞，用生理盐水反复洗涤，制备淋巴细胞液后在患者前臂内侧或上臂外侧处作皮内多点接种，2～3周后再次注射，共3～4次，可依据患者病情进行个体化调整。

1.3 流式细胞检测所用实验试剂及步骤FACS Calibur流式细胞仪为美国Becton Dickinson公司生产，CD16 FITC、CD56 PE、CD3 PerCP、CD69 APC鼠抗人荧光单克隆抗体均购自美国BD公司，4℃避光保存。将流式专用试管按顺序进行检测项目和检测标本编号，取抗凝外周血约50µl，依次加入抗体CD16 FITC 8～10µl、CD56 PE 8～10µl、CD3 PerCP 8～10µl、CD69 APC 2～4µl进行标记，摇匀，避光孵育15 min。裂解后磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，离心弃上清，制备PBS悬液约350µl，上机检测。

1.4 统计学方法应用SPSS13.0统计软件进行数据分析，计量数据以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用两独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组受试者治疗前的NK细胞亚群表型变化比较RPL组患者的外周血CD3-CD56+NK细胞比例明显高于健康对照组(P＜0.05)，而CD56brightCD16-NK、CD56dimCD16+NK、自然杀伤T细胞(NKT)及活化NK细胞比例比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，见表1。

表1 两组受试者治疗前的NK细胞亚群表型变化比较(±s，%)

表1 两组受试者治疗前的NK细胞亚群表型变化比较(±s，%)

组别RPL组(n=30)健康对照组(n=26) t值P值CD3-CD56+17.07±8.19 10.69±7.21 3.072 0.0033 CD3+CD56+5.57±4.37 5.90±3.88 0.297 0.7678 CD56dimCD16+88.12±9.99 87.06±8.14 0.431 0.6682 CD56brightCD16-3.50±2.90 3.79±2.87 0.375 0.7091 CD56+CD69+4.89±2.26 4.92±2.05 0.0517 0.9590

2.2 RPL淋巴细胞免疫治疗后NK细胞亚群表型变化比较经过治疗后，患者外周血CD3-CD56+NK细胞比例从治疗前的(17.07±8.19)降为治疗后的(10.02±7.32)，差异有统计学意义(P＜0.05)，而其余亚群比例治疗前后比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，见表2。

表230 例RPL患者淋巴细胞免疫治疗后NK细胞亚群表型变化(±s，%)

表230 例RPL患者淋巴细胞免疫治疗后NK细胞亚群表型变化(±s，%)

时间治疗前治疗后t值P值CD3-CD56+17.07±8.19 10.02±7.32 3.515 0.0009 CD3+CD56+5.57±4.37 4.22±5.73 1.026 0.3091 CD56dimCD16+88.12±9.99 86.12±9.21 0.806 0.4234 CD56brightCD16-3.50±2.90 3.98±2.40 0.698 0.4877 CD56+CD69+4.89±2.26 4.11±2.49 1.270 0.2090

3 讨论

3.1 妊娠免疫耐受机制以及反复妊娠丢失发生的免疫失衡机理妊娠丢失多数被认为是一种对异常染色体受精卵的自然淘汰现象，而反复妊娠丢失与散发性妊娠丢失则不同。研究发现常见妊娠丢失的原因包括遗传、免疫、感染、解剖、内分泌等因素，但也有很多患者发病原因不明，被称为原因不明反复妊娠丢失，研究报道原因不明反复妊娠丢失占反复妊娠丢失患者的40%～60%[1]，是目前临床以及学术界关注的重点。随着基础免疫学及免疫遗传学的发展，越来越多的研究发现绝大部分不明原因的反复妊娠丢失病因与母胎免疫调节紊乱有关。正常妊娠是一种半同种异体移植，胎儿与母体间存在免疫平衡关系，这种平衡有赖于妊娠妇女对妊娠半同种抗原所表现的一种免疫耐受，而正常的妊娠免疫耐受涉及诸多因素，其中任何一个环节出现异常，都有可能导致妊娠失败。胚胎作为同种半异体移植物，携带的父系抗原表达在母胎交界的滋养细胞表面，通过探讨胚胎获得“免疫耐受”的机制，为寻找治疗反复妊娠丢失乃至器官移植的有效方法提供更充分的理论依据[2]。从生殖免疫角度分析，妊娠的维持极其复杂，涉及诸多因素。近年来国内外学者的研究主要从以下几个方面解释反复妊娠丢失的发病机制，即封闭抗体、Thl/Th2平衡、NK细胞以及CD4+CD25+Treg细胞功能等方面，其中NK细胞的变化是目前研究的热点。

3.2 反复妊娠丢失患者NK细胞的变化NK细胞属于淋巴细胞谱系细胞群，占外周血淋巴细胞数量的10%～15%，是机体天然免疫系统重要的组成部分，是一类既不需要抗原刺激、又不需抗体参与即能杀伤某些靶细胞的非T非B类淋巴细胞，也就是说无需抗原预先致敏就自发杀伤靶细胞，因此，NK细胞有细胞毒性效应。针对反复妊娠丢失患者外周血免疫细胞的变化研究目前报道较多，研究认为，妊娠妇女外周血NK细胞升高可能会导致妊娠丢失[3]。同时NK细胞毒性、数量及活性增加与妊娠丢失有关，外周血高水平的NK细胞提示可能发生生化妊娠或妊娠丢失[4]。有些学者甚至提出采用外周血CD56+NK细胞所占比例作为妊娠结局的预测指标[5]。研究发现，正常情况下，早期妊娠NK细胞活性较未孕时明显降低，表明减少NK细胞的比例和抑制其活性也许能阻止母体免疫系统对胎儿抗原的攻击，从而维持正常妊娠。

3.3 异源淋巴细胞免疫治疗对NK细胞变化影响反复妊娠丢失作为一种常见的病理妊娠，约占整个妊娠的10%～15%[6]。研究发现，父方淋巴细胞作为滋养层淋巴细胞交叉反应刺激抗原，使之产生抗丈夫异源淋巴细胞抗体，增大组织相容性抗原(HLA)的组织相容性。有学者提出，反复妊娠丢失是由于母体不能识别父方抗原，从而不能产生封闭抗体，导致胚胎被母体的免疫系统所排斥[7]，采用配偶或第三方异源淋巴细胞免疫治疗诱导母体产生保护性封闭抗体，使胎儿免受母体免疫系统及子宫局部免疫组织的排斥与攻击，维持正常妊娠。对同种免疫型反复妊娠丢失患者采用丈夫或第三方异源淋巴细胞进行同种致敏治疗，抑制母胎间的细胞性免疫排斥反应减少妊娠丢失的发生。采取皮内注射丈夫的异源淋巴细胞治疗复发性自然流产(RSA)患者，防止了胚胎被母体免疫系统的杀伤而发生妊娠丢失，使胎儿易于存活，妊娠成功率提高[8]，但其作用机制是否与降低NK细胞的数量以及活性有关，尚不明了。

近几年对NK细胞亚群CD69+活化NK细胞，CD3+CD56+NKT细胞进行大量的研究。活化NK细胞直接反映了细胞的免疫活性，研究发现NKT细胞升高的患者，免疫功能出现异常，可能导致妊娠丢失，需要积极的干预治疗[9]。本研究结果显示，经异源淋巴细胞免疫治疗后总的NK细胞显著降低，与对照组比较差异有统计学意义。可见，异源淋巴细胞免疫治疗能明显降低NK细胞的比例，有利于妊娠维持。对NK细胞亚群进行分析则发现，异源淋巴细胞免疫治疗并不能改变其亚群在NK细胞中的比例，而且治疗后CD69+活化NK细胞及CD3+CD56+NKT细胞的比例也未发生明显变化，是否与本研究病例少有关，值得进一步研究。

综上所述，检测NK细胞免疫表型变化有助于反复妊娠丢失患者病因分析，动态监测有利于观察异源淋巴细胞免疫治疗的疗效，从而避免妊娠丢失的再次发生，减少患者的痛苦。

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R714.2

B

1003—6350（2016）02—0282—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.02.036

2015-06-06)

广东省社会发展科技“临床医学”重点课题(编号：2011A030400011)

范格英。E-mail：15019609910@163.com