粉红粘帚霉对玉米茎基腐病的抑菌防病作用

杨蕊,郎剑锋,陆宁海,石明旺

（河南科技学院,河南新乡453003）

粉红粘帚霉对玉米茎基腐病的抑菌防病作用

杨蕊,郎剑锋,陆宁海,石明旺

（河南科技学院,河南新乡453003）

为研究粉红粘帚霉对玉米茎基腐病的抑菌防病作用,采用PDA平板和水琼脂对峙培养法测定粉红粘帚霉的抑菌作用,采用扣皿法测定挥发性代谢产物的抑菌作用,采用含毒介质法测定发酵液的抑菌作用,测定孢子液对玉米种子的促生作用,通过室内盆栽试验测定粉红粘帚霉的苗期防病效果.结果表明：粉红粘帚霉对玉米茎基腐病具有生防潜力.病菌菌落扩展受到明显抑制,粉红粘帚霉菌丝重寄生病菌菌丝,导致菌丝细胞原生质颗粒化、溃解；挥发性代谢产物对病菌菌丝生长无抑制作用；JM发酵滤液对病菌菌丝生长具有抑制作用,且第9天的抑菌活性最好,菌丝生长抑制率为50%；孢子液可以在一定程度上提高种子萌发率和单株鲜质量；粉红粘帚霉对苗期玉米茎基腐病具有一定的防病效果.

粉红粘帚霉；禾谷镰刀菌；生物防治

玉米茎基腐病（corn stalk rot）,又称青枯病,由多种病原菌侵染引起,可造成玉米根系和茎基腐烂,一般年份发病率10%～20%,严重年份可达50%～60%[1].近年来,由于推广品种普遍对茎基腐病的抗性水平较低,以及秸秆还田技术的推广,造成田间病原菌的积累,玉米茎基腐病在河南省发病情况逐渐加重[2-3].

玉米茎基腐病病原复杂[4-5],生产上主要采用以抗病品种为中心的农业防治措施,由于推广的主栽品种抗性水平普遍较低,应用生物防治手段防治该病害日益受到人们的重视[6].已报道的玉米茎基腐病生防菌以细菌居多[7],对于其生防真菌的研究报道相对较少,生防真菌主要有球毛壳霉（Chaetomium globosum）、木霉属（Trichoderma spp）、绿粘帚霉（Gliocladium virens）CH-3等[8-9].粉红粘帚霉（Clonostachys rosea）是一种重要的重寄生真菌,寄主范围广,开发潜力大[10].粉红粘帚霉用于灰霉病、菌核病和水稻纹枯病的防治效果明显[11-14],而对于利用此生防菌防治玉米茎基腐病,尚未见相关报道.因此,很有必要评估粉红粘帚霉对玉米茎基腐病的生防潜力.本研究以禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）为指示菌,对粉红粘帚霉的抑菌作用、促生作用、苗期防病潜力等进行了初步研究,旨在为玉米茎基腐病生防菌剂的研发和应用提供理论参考.

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株供试粉红粘帚霉菌株（C.rosea）和病原禾谷镰刀菌（F.graminearum）菌株均由河南科技学院资源与环境学院植物病理学教研室提供.

1.1.2 供试培养基本研究中使用的培养基配方如下：

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potatodextrose agar,简称PDA）：去皮马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL,121℃灭菌25 min备用[15].

JM液体培养基：淀粉30 g/L,蛋白胨2 g/L,蒸馏水1 000 mL[16].

水琼脂培养基（water agar,简称WA）：琼脂条20 g,蒸馏水1 000 mL[17].

1.2 试验方法

1.2.1 粉红粘帚霉对病菌的抑制作用采用平板对峙法,测定粉红粘帚霉对禾谷镰刀菌菌丝生长的抑菌作用.取新鲜培养的粉红粘帚霉菌饼（直径5 mm）接种至PDA平板（直径9 cm）,4 d后接种病菌菌饼,菌饼中心相距5 cm,以仅接病菌平板为对照,3次重复.25℃恒温培养3～5 d,逐日观察菌落生长情况并镜检病菌菌丝生长情况.

将水琼脂培养基（WA）倒入放有无菌载玻片的培养皿中,培养基的厚度以刚好覆盖住载玻片为好,在载玻片上形成水琼脂膜.载玻片一端先接种粉红粘帚霉菌饼（直径5 mm）,3 d后,载玻片另一端接种病菌菌饼,6次重复.25℃恒温培养,待两种菌菌丝接触后,取出载玻片光学显微镜下逐日观察重寄生情况.

1.2.2 粉红粘帚霉挥发性代谢产物的抑菌作用采用扣皿法[18],将活化2 d的粉红粘帚霉菌饼（直径5 mm）接种至PDA平板（直径9 cm）上,放在25℃恒温培养箱中培养.待其菌落直径长到5 cm时,在上方盖上双层圆形无菌滤纸（直径10 cm）,再在滤纸上方扣上接种了病菌菌饼的PDA平板（撤去培养皿盖,直径9 cm）.并用透明胶带将两皿固定密封好,下层为粉红粘帚霉平板,上层为病菌平板.以未接种粉红粘帚霉的PDA平板和只接种病菌的平板对扣处理为对照,3次重复.22℃恒温培养,逐日测量病原菌菌落直径.

1.2.3 粉红粘帚霉发酵液的抑菌作用JM液体培养基摇培粉红粘帚霉,每瓶接种3个菌块（直径5 mm）, 150 r/min,30℃振荡培养.分别在培养6 d、9 d、12 d后取样,培养物经2层擦镜纸过滤,滤液3 000 r/min离心15 min,上清液分别经0.45 μm、0.22 μm滤膜过滤,收集滤液,-20℃保存备用.配制体积分数为20%的发酵液,测定其对禾谷镰刀菌菌丝生长的影响.方法如下：4 mL发酵液+16 mL PDA融合成含药平板.将病菌菌饼（直径5 mm）接种于平板中心,以4 mL无菌水+16 mL PDA混合均匀倒平板为对照,3次重复.25℃恒温培养,3 d后测定病菌菌落直径,计算菌丝生长抑制率.

1.2.4 粉红粘帚霉对玉米种子萌发的影响用粉红粘帚霉分生孢子悬浮液（每mL含孢子1.0×107个）浸泡玉米种子2 h,晾干,移入铺有无菌湿润滤纸的培养皿内,对照组种子用无菌水浸泡,每皿10粒,3次重复.25℃恒温培养7 d后,测量玉米种子的发芽率及幼苗的芽长、根长、单株鲜质量.

1.2.5 苗期防病效果测定将接种病菌的麦粒培养基与无菌土按照质量比1∶20的比例混合均匀,置于营养钵中,然后将不同处理的玉米种子播种在营养钵内,每钵10粒玉米种子,每处理5个钵.4个处理分别为粉红粘帚霉孢子液（每mL含孢子7.5×107个）浸种4 h,粉红粘帚霉9 d发酵液浸种4 h,敌委丹药剂拌种（药剂与种子质量比为1∶167～200）,敌委丹稀释液浸种4 h（每kg种子含敌委丹有效成分3.38 g）.以无菌水浸泡4 h为对照,3次重复.待玉米苗长到4～5叶期,调查病情[19].

2 结果与分析

2.1 粉红粘帚霉对禾谷镰刀菌的抑制作用

粉红粘帚霉对禾谷镰刀菌菌丝生长的抑制作用见图1,对禾谷镰刀病菌的重寄生作用见图2.

由图1可知,PDA平板对峙试验中,粉红粘帚霉对禾谷镰刀菌菌丝生长具有明显的抑制作用.对峙培养3 d后,对照病菌菌落平均半径达到57.7 mm,而处理病菌菌落平均半径为33.0 mm,t检验结果表明,处理与对照间存在极显著性差异（P＜0.01）.

由图2可知,PDA对峙平板上,病菌菌落生长受到明显抑制,随着培养时间的延长,粉红粘帚霉菌落逐步覆盖病菌菌落.光学显微镜镜检发现,粉红粘帚霉对病菌具有重寄生作用.对照平板上,病菌菌丝质地均匀,分支正常；而处理平板上,粉红粘帚霉菌丝平行延伸、缠绕并穿透病菌菌丝,受到粉红粘帚霉重寄生作用的病菌菌丝发生溃解,分支出现异常,菌丝细胞原生质颗粒化、外渗.

2.2 粉红粘帚霉挥发性代谢产物对禾谷镰刀菌的抑菌作用

粉红粘帚霉挥发性代谢产物对禾谷镰刀菌菌丝生长的影响见表1.

由表1可知,粉红粘帚霉挥发性代谢产物抑菌活性测定试验中,共培养1 d,对照病原菌菌落直径为16.2 mm,处理病原菌菌落直径为17.3 mm,对照与处理间差异不显著；共培养2 d,对照菌落直径为37.8 mm,处理菌落直径为39.7 mm,差异不显著；共培养3 d,对照菌落直径为56.2 mm,处理菌落直径为55.2 mm,差异不显著；共培养4 d,对照菌落直径为76.8 mm,处理菌落直径为82.7 mm,差异显著.表明粉红粘帚霉挥发性代谢产物对病菌菌丝生长无抑制作用.

2.3 粉红粘帚霉发酵液对禾谷镰刀菌的抑菌作用

粉红粘帚霉JM培养物滤液对禾谷镰刀菌菌丝生长的影响见图3.

由图3可知,在JM培养基摇培6 d后,培养液中未检测到抑菌活性.从第6天至第9天,随着培养时间的延长,抑菌活性呈上升趋势,第9天培养液的菌丝生长抑制率为50%,之后,培养液的抑菌活性下降,至第12天,培养液的抑菌活性为16%.对照与各处理间的差异达到显著水平（P＜0.05）.

2.4 粉红粘帚霉对玉米种子萌发的影响

粉红粘帚霉对玉米种子萌发的影响见表2.

由表2可知,粉红粘帚霉对玉米种子的萌发有一定的促进作用.玉米种子经粉红粘帚霉分生孢子液浸泡处理后,对照萌发率为85%,处理萌发率为86.3%,对照与处理之间无显著差异；对照芽长为7.7 mm,处理芽长为6.8 mm,对照与处理之间差异不显著；对照根长为31.3 mm,处理根长为30.4 mm,对照与处理间无显著差异.对照单株鲜质量为0.64 g,而处理单株鲜质量为0.66 g,对照与处理之间存在显著差异（P＜0.05）.

2.5 粉红粘帚霉对玉米茎基腐病的苗期防病效果

粉红粘帚霉及敌萎丹等对玉米茎基腐病的苗期防病效果见图4.

由图4可知,粉红粘帚霉JM发酵液和分生孢子液对禾谷镰刀菌侵染玉米具有一定的抑制作用.表现在粉红粘帚霉JM发酵液和分生孢子液处理病情指数均显著低于对照处理（P＜0.05）.对照病情指数为64,粉红粘帚霉发酵液处理病情指数为59,粉红粘帚霉孢子液处理病情指数为56.9,敌萎丹药剂浸种处理病情指数为53.3,敌萎丹药剂拌种处理病情指数为51.1,5个处理间存在显著性差异.由试验结果可看出,粉红粘帚霉孢子液处理的效果要好于JM发酵液处理,但低于药剂处理对病菌侵染的抑制效果.

3 结论与讨论

粉红粘帚霉对多种植物病原菌都有很强的抑制作用,其生防机制主要包括拮抗、重寄生和诱导植物抗性,开发潜力巨大.本试验结果表明,粉红粘帚霉对玉米茎基腐病病菌禾谷镰刀菌具有明显的抑制作用.平板对峙试验中,粉红粘帚霉菌落寄生禾谷镰刀菌菌落,使其菌落扩展受到抑制.重寄生是粉红粘帚霉重要的生防机理,菌丝显微观察也发现,粉红粘帚霉菌丝重寄生禾谷镰刀菌菌丝,导致其菌丝出现生长异常、溃解.扣皿试验结果表明,挥发性代谢产物对禾谷镰刀菌菌丝生长无抑制作用.粉红粘帚霉发酵液可抑制水稻纹枯病菌菌丝的生长[13,20].本试验结果也表明,粉红粘帚霉JM培养物滤液对禾谷镰刀菌菌丝生长具有明显的抑制作用.环境pH值可调控真菌次生代谢产物的产生,试验中粉红粘帚霉JM培养物滤液抑菌活性随培养时间而变化,共培养9d抑菌活性最高,随后下降,这是否与环境pH值调控有关,还有待于进一步研究.

粉红粘帚霉能够提高水稻发芽率,促进水稻幼苗生长[13],对番茄种子萌发和幼苗生长也有促进作用[21].本试验结果表明,粉红粘帚霉对玉米种子具有促生作用,其孢子液可以在一定程度上提高种子萌发率和单株鲜质量.玉米苗期防效试验结果表明,粉红粘帚霉对玉米苗期禾谷镰刀菌的侵染具有明显的抑制作用.无论是发酵液还是孢子液均在一定程度上减轻病害的发生,相比较而言,孢子液的防病效果要好于发酵液.因此,利用粉红粘帚霉防治玉米茎基腐病具有一定的开发潜力.

粉红粘帚霉作为微生物生防制剂,其防效受到寄主、环境条件及施用方式等多方面的影响.本研究结果表明,粉红粘帚霉对玉米茎基腐病具有生防潜力,尤其是重寄生机制方面.今后,将进一步展开粉红粘帚霉菌株的施用方式、在土壤中消长动态以及生防菌与病原菌的互作等方面的研究,以期为挖掘玉米茎基腐病生防资源及其应用提供理论依据.

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（责任编辑：邓天福）

Inhibition and protective activities of Clonostachys rosea to corn stalk rot

YANG Rui,LANG Jianfeng,LU Ninghai,SHI Mingwang
（Henan Institute ofScience and Technology,Xinxiang453003,China）

The article aimed to evaluate the efficacy of Clonostachys rosea in suppression of corn stalk rot caused by Fusarium graminearum.Confrontation culture in PDA and WA（water agar）plate were used to test the inhibitory effect of C.rosea on mycelial growth of F.graminearum.Dish buckle and Toxic media was used to test the inhibitory effect of volatile metabolites and cultural filtrates,respectively.Conidia solution was used to test the growth-promoting effect on corn seed.The efficacy of C.rosea in suppression of the infection by F.graminearum was tested by indoor pot experiment.The results showed that C.rosea can be potentially exploited as an agent to control corn stalk rot.The colony expansion of F.graminearum was inhibited in confrontation culture plates,and the hyphae were parasitised by C.rosea.The inhibited mycelia of F.graminearum showed severe abnormal symptoms including cytoplasma granulation and outward leakage,cellular swelling and collapse.No inhibitory effect on mycelial growth of F. graminearum was observed by volatile metabolites of C.rosea.The mycelial growth of F.graminearum were suppressed by the JM cultural filtrate,especially on 9th day,mycelial growth inhibition rate was 50%.The germination of seed and plant fresh weight were promoted by conidia solution of C.rosea to a certain degree.C.rosea was some effective in suppression of F.graminearum in the seedling stage.

Clonostachys rosea；Fusarium graminearum；biological control

S476

A

1008-7516（2016）05-0028-06

10.3969/j.issn.1008-7516.2016.05.006

2016-08-12

河南省教育厅科学技术研究重点项目（13B210012）；河南科技学院高层次人才科研启动项目（06030）

杨蕊（1980―）,女,河南新乡人,硕士,讲师.主要从事植物病害生物防治方面的研究.