三水白虎汤含药血清抑制类风湿关节炎滑膜成纤维细胞迁移的临床研究

何知广 胡海平 伍敏生

三水白虎汤含药血清抑制类风湿关节炎滑膜成纤维细胞迁移的临床研究

何知广 胡海平 伍敏生

目的探讨三水白虎汤(SSBH)含药血清抑制类风湿关节炎(RA)滑膜成纤维细胞(FLS)迁移的临床研究。方法利用组织块培养法来收集RA滑膜FLS,并进行体外传代培养,将20只大鼠随机分为对照组与研究组,各10只。选取3-6代细胞分别加入对照组(生理盐水制备的血清培养)与研究组(SSBH含药血清培养),在培养72 h后,提取细胞总蛋白,通过双向凝胶电泳(2-DE)将细胞总蛋白进行分离,利用凝胶经银染显色与图像数据来识别差异细胞蛋白的位点,随后对差异细胞蛋白的位点进行鉴别。结果两组滑膜成纤维细胞蛋白的双向凝胶电泳图谱都出现差异细胞蛋白质点,在差异蛋白表达量超过3倍的中蛋白质点中选择26个差异细胞蛋白质点实施质谱分析,总共鉴定出24种上升的白细胞介素-1(IL-1)受体拮抗蛋白。研究组SSBH 含药血清对 RA-FLS 分泌 IL-1、白细胞介素-2(IL-2)影响优于对照组(P＜0.05)。结论SSBH可以通过类风湿关节炎患者FLS中的IL-1受体拮抗蛋白来抑制滑膜增生,同时也是治疗类风湿关节炎的一种药理机制。

三水白虎汤；类风湿关节炎；滑膜成纤维细胞

RA是一种常见的慢性疼痛性疾病,呈侵蚀性、进行性发展,对类风湿关节炎若不及时治疗,极易造成患者关节囊破损、关节软骨,严重时还会导致关节畸形,甚至出现关节功能障碍［1］。本文主要通过2-DE与质谱技术有效分析SSBH含药血清体外培养类风湿关节炎患者的关节滑膜成纤维细胞蛋白表达图谱,寻找抑制FLS增生的靶点,为类风湿关节炎治疗提供有效的参考依据。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取20只SPF级SD雄性大鼠为研究对象,平均体重(200±20)g,主要由医科大实验中心提供(许可证号SCXK：2012-0017)。滑膜组织主要来自南方医院确诊类风湿关节炎患者的膝关节。SSBH则由医科大中医院药房提供［2］。

1.2 方法

1.2.1 SSBH含药血清设备与老鼠分组 应先进行2次水煎SSBH,混合2次水煎进行取液浓缩,浓度为含生药2 g/ml,将大老鼠随机分为对照组(生理盐水制备的血清培养)与研究组(SSBH含药血清培养),各10只。研究组给予2ml的SSBH灌胃,对照组给予等量的生理盐水,持续给药1周左右［3］。在进行采血时,前1 d晚上应给大鼠禁食,不禁水,次日清晨末进行给药90min,随后进行动脉采血,取血清。在56°的温水中水浴30min灭活,0.22 μm除菌滤膜抽滤除菌,在-20℃温度下进行保存。

1.2.2 培养滑膜细胞原代 先将滑膜组织剪成1 mm3左右,将其平均排列在培养瓶的培养面,随后翻转培养瓶,并向瓶中添加20%的FBS培养液,将其放置在37℃的二氧化碳培养箱中进行培养；在4 h孵育后待组织块贴附,将其培养瓶进行翻转,平放,继续培养；在3～4 d后可通过镜下观察组织块旁边的FLS是否成片生长,去除组织块之后,再进行培养；当滑膜细胞覆盖≥80%的培养瓶底面时,进行消化传代。最后取3-6代的FLS进行鉴定备用［4］。

1.2.3 抽提滑膜细胞总蛋白 将100 μl细胞裂解液加入到每个1.5×106滑膜细胞中,对其进行吹打,使细胞和裂解液进行接触,放置1 h后,离心4℃ 40000 g,从中吸取上清液,为细胞总蛋白质,在-80℃中进行保存备用。

1.2.4 滑膜细胞总蛋白分离及染色 抽取蛋白样品、上样缓冲液,将两者进行混合,将其加入水化盘中,用镊子除去IPG胶条上的保护层,把胶面朝下放置在水化盘样品的溶液之上,1 h后利用矿物油进行密封,在室温的条件下密封16 h左右,随后取出胶条,清除多余的液体,将胶条放置在聚焦槽中,加覆盖矿物油,进行第一向等电聚焦电泳。在聚焦后,取出胶条使其平衡15min,再进行第二向SDS电泳,电泳结束后,取出凝胶利用银染方法进行显色［5］。

1.3 观察指标 观察对比两组差异蛋白及SSBH含药血清对RA-FLS增殖的影响。

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示,采用t检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组差异蛋白比较 两组滑膜成纤维细胞蛋白的双向凝胶电泳图谱都出现差异细胞蛋白质点,在差异蛋白表达量超过3倍的中蛋白质点中选择26个差异细胞蛋白质点实施质谱分析,总共鉴定出24种上升的IL-1受体拮抗蛋白。研究组SSBH 含药血清对 RA-FLS 分泌 IL-1、IL-2 影响优于对照组(P＜0.05)。见表1。

2.2 SSBH含药血清对RA-FLS增殖的影响 SSBH含药血清可呈剂量与时间依赖性抑制RA-FLS的增殖见表2。

表1 SSBH 含药血清对 RA-FLS 分泌 IL-1、IL-2 影响(±s,pg/ml)

表1 SSBH 含药血清对 RA-FLS 分泌 IL-1、IL-2 影响(±s,pg/ml)

注：与对照组比较,aP＜0.05

组别 只数 IL-1 IL-2对照组 10 568.32±27.40 146.072±14.640研究组 10 502.21±12.43a 105.500±10.320a

表2 SSBH含药血清对RA-FLS增殖的影响(±s)

表2 SSBH含药血清对RA-FLS增殖的影响(±s)

项目 时间 10% 20% 30% RA-SSBH 24 h 0.1550±0.0700 0.1450±0.0140 0.1220±0.0070 48 h 0.1320±0.0300 0.1120±0.0030 0.1040±0.0200 72 h 0.1210±0.0040 0.1010±0.0012 0.1010±0.0013 RA-FLS 24 h 0.1440±0.0170 0.1260±0.0020 0.1230±0.0040 48 h 0.1310±0.0006 0.1150±0.0015 0.1150±0.0017 72 h 0.1300±0.0001 0.1550±0.0001 0.1040±0.0001

3 讨论

蛋白质SSBH技术为RA的临床研究提供了一个新的技术平台。目前,国内外使用的2-DE技术与质谱技术对类风湿关节炎患者血浆、滑膜组织、滑膜细胞蛋白质等进行研究发现,RA中具有多种特异性的蛋白表达［6］。本研究将20%FBS培养液进行72 h的培养后,可最大化抑制细胞增殖、降低滑膜细胞,进行细胞总蛋白的抽提,通过2-DE技术与质谱技术分析SSBH含药血清体外培养的类风湿关节炎患者FLS蛋白表达图谱,利用生理盐水对空白对照组的差异绩效分析,寻找最佳作用的浓度与时间以及抑制滑膜细胞增殖的作用靶点。研究表明,两组滑膜成纤维细胞蛋白的双向凝胶电泳图谱都出现差异细胞蛋白质点,在差异蛋白表达量超过3倍的中蛋白质点中选择26个差异细胞蛋白质点实施质谱分析,总共鉴定出24种上升的IL-1受体拮抗蛋白。

综上所述,SSBH可以通过类风湿关节炎患者FLS中的IL-1受体拮抗蛋白来抑制滑膜的增生,同时也是治疗类风湿关节炎的一种药理机制。

［1］高燕,肖长虹,潘超,等.三水白虎汤对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖的蛋白质组学影响.山东医药,2013,53(21):7-9.

［2］高燕,肖长虹,潘超,等.三水白虎汤对滑膜成纤维细胞增殖及IL-6、IL-17分泌的影响.中国中西医结合杂志,2013,33(10): 1385-1388.

［3］陈德超,肖长虹,吴启富,等.四甲基偶氮唑盐法观察三水白虎汤含药血清对体外培养关节炎滑膜细胞增殖的影响.中国组织工程研究与临床康复,2013， 11(19):3669-3672.

［4］潘超,肖长虹,高燕,等.噬菌体随机十二肽库淘选三水白虎汤作用于类风湿关节炎滑膜细胞的靶点研究.中国免疫学杂志,2014， 30(4):446-448.

［5］夏卿,冯小辉.中药含药血清对体外培养类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞影响的实验研究.河南中医,2014， 34(3):456-457.

［6］高华利,欧阳桂林,黄新星,等.补肾强骨方含药血清对滑膜成纤维细胞增殖及PCNA和Bcl-2表达的影响.中国骨伤,2012,2(11):942-945.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2016.10.216

2016-02-25］

510150 广州医科大学附属第三医院药学部(何知广伍敏生)；中山大学附属第一医院(胡海平)