复合蛋白酶和风味蛋白酶双酶水解羊骨粉的研究

王钰慧，甄守艳，霍乃蕊，张琪，郭娟

(1.山西农业大学 食品科学与工程学院，山西 太谷 030801； 2.山西农业大学 动物科技学院，山西 太谷 030801)



复合蛋白酶和风味蛋白酶双酶水解羊骨粉的研究

王钰慧1，甄守艳1，霍乃蕊2*，张琪1，郭娟1

(1.山西农业大学 食品科学与工程学院，山西 太谷 030801； 2.山西农业大学 动物科技学院，山西 太谷 030801)

摘要：为了进一步提高水解程度，以复合蛋白酶和风味蛋白酶双酶水解羊骨粉，比较同步水解和顺序水解效果，确定较优水解方式和条件。结果表明两种酶的顺序水解效果不及同步水解。双酶同步水解整体上优于单酶水解，且底物浓度9%、pH7.5时各指标均高于底物浓度12%、pH6时的水解效果。本研究确定的这两种酶水解羊骨粉的方式为同步水解，条件为：骨粉添加量9%、复合蛋白酶添加量5%(E/S)、风味蛋白酶添加量为4.25%(E/S)、调节起始pH值为7.5，50 ℃水解315 min，此时的水解度为29.21%、氨基态氮含量为27.29%、多肽生成量为87.13 mg·g-1、短肽得率为57.24%，其中多肽生成量和短肽得率极显著地高于单酶水解的67.75 mg·g-1和43.39%(p<0.01)。

关键词：复合蛋白酶；风味蛋白酶；同步水解；顺序水解；骨胶原肽

我国羊骨资源丰富，酶解是羊骨深加工的一种有效渠道，可实现营养价值和生理功能的双重改善[1],提高其附加值和利用效率。羊骨蛋白中90%以上为胶原蛋白,一般水解度越大,胶原多肽或胶原短肽的得率也越大，胶原肽的生理活性便越强。本实验室前期研究结果表明，复合蛋白酶、碱性蛋白酶和风味蛋白酶是水解羊骨粉制备胶原多肽水解度最大的3种酶。为了进一步提高水解度，本研究以复合蛋白酶和风味蛋白酶双酶水解羊骨粉，比较同步水解和顺序水解效果，确定较优水解方式和条件，为羊骨深加工提供参数支持，并有助于养羊产业链的延伸。

1材料

1.1　原料与试剂

脱脂羊骨粉由实验室自制。风味蛋白酶(酶活≥20 000 U·mg-1，厂家：Solarbio)，复合蛋白酶(酶活≥120 000 U·mg-1，厂家：Solarbio)。OPA试剂现配现用，丝氨酸、酪氨酸等均为分析纯。

1.2　仪器设备

722G可见分光光度计(上海精密仪器有限公司)；台式高速冷冻离心机(Neofuge23R，上海力申科学仪器有限公司)；802型索式抽提器(天津市玻璃仪器厂)等。

2方法

2.1　风味蛋白酶和复合蛋白酶最优水解条件

经单因素试验和响应面分析确定的风味蛋白酶最优水解条件为：料液比12%(W/V)、加酶量为3.48%(E/S)，调节起始pH值为6，55 ℃水解315 min，水解度约为20.38%。同样方法确定的复合蛋白酶最优水解工艺为pH 7.5，料液比为9%，加酶量为5%(E/S)，55 ℃水解300 min、水解度约为28.54%。

2.2　指标测定

酶解结束后，5 000 r·min-1离心15 min, 取上清液进行各项指标的测定。

氨基酸态氮的测定采用中性甲醛滴定法[2]；水解度测定采用邻苯二甲醛法[1]；多肽生成总量以不被TCA所沉淀的多肽计算,其中总氮测定采用福林-酚法[3]；短肽不被15%TCA所沉淀，15%三氯乙酸中的可溶性氮的测定采用福林-酚法，原料中总氮含量采用凯氏定氮法测定。

2.3　同步水解

这两种酶在优化的单酶水解工艺条件中水解温度相同，但底物浓度和pH值不同，为此设计表1、表2。分别探讨在9%、12%料水比时不同pH条件下，50 ℃水解315 min的双酶水解效果，并将其与单酶最优水解条件下的各指标进行比较。

2.4　顺序水解

在底物浓度9%时，复合蛋白酶和风味蛋白酶按顺序在最优条件下水解，确定二者的较适时间比。底物浓度为12%时，先风味蛋白酶后复合蛋白酶水解羊骨粉，确定较适时间比。

2.5　统计分析

所有数据均用平均值加减标准差表示，利用Statistix 8.1软件进行方差分析。

3结果与分析

3.1　同步水解结果

由表1可以看出，对于水解度而言，只有AB4组显著高于B组，其他组别之间差异不显著；对于水解液中的氨基态氮含量，所有AB组合以及A组均显著高于B组。但B组的多肽生成量显著高于其他各组，AB4组显著高于其他双酶组合及A组。AB4组的短肽生成量显著高于其他双酶组合及A、B单酶水解，因此当底物浓度为9%时，两种酶同时水解，pH7.5是较优条件。

表1　羊骨骨粉(9%)复合蛋白酶和风味蛋白酶双酶同步水解及各水解指标的测定结果

注：A为复合蛋白酶;B为风味蛋白酶;AB表示双酶同步水解。数值右上角不同字母表示同一指标内差异显著(p<0.05)，表2同。

Note：A：Protamex; B：Flavourzyme;AB stands for simultaneous hydrolysis by A and B. Different letters to the up-right corner of the value means significant difference. Same to table 2.

由表2可以看出，当底物浓度为12%时，反应310 min，同步水解的水解度均高于底物浓度为9%的水解度，说明底物浓度对其影响较大。底物浓度为12%时，双酶酶解的水解度均显著高于风味蛋白酶。氨基态氮含量各组之间差异不显著，风味蛋白酶B单酶水解多肽生成量显著高于其他组，AB1组显著高于其他双酶组及A组，且AB1组的短肽得率显著高于其它组合及单酶水解。因此当底物浓度为12%时，双酶水解的较适pH值为6。

表2　羊骨骨粉(12%)复合蛋白酶和风味蛋白酶双酶同步水解及各水解指标的测定结果

3.2　顺序水解

由表3可以看出，当时间比为1∶1时，水解度最大，显著高于3∶1和1∶3，但与其他组差异不显著，且与同步水解的最大水解度大致相同；氨基态氮数值在时间比为1∶1时，数值最大，与其他组差异不显著，但高于同步水解。所有比例的多肽生成量显著低于同步水解。最大短肽生成量也与同步水解数值相近。总之，先复合后风味蛋白酶的顺序水解效果不及同步效果好。

由表4可知，无论何种时间比例，水解度均高于同步水解，但氨基态氮含量、多肽生成量整体上低于同步水解和先复合后风味蛋白酶的顺序水解。短肽生成量的最大值也低于同步水解和先复合后风味蛋白酶的顺序水解。

表3　底物浓度9%时复合蛋白酶和风味蛋白酶以不同时间比顺序水解羊骨骨粉效果比较

注：酶解总时间为620 min。数值右上角不同字母表示同一指标内差异显著(p<0.05)。表4同。

Note: The total reaction time was 620 min. Different letters to the up-right corner of the value means significant difference. Same to table 4.

表4　骨粉浓度为12%时风味蛋白酶和复合蛋白酶不同时间比双酶顺序水解结果

4讨论

复合蛋白酶和风味蛋白酶是水解羊骨粉效果较好的两种酶，双酶复合水解将会加大水解程度，产生更多的多肽或短肽，这样其生物利用度和活性功能将会更强。本研究结果表明，同步水解效果优于顺序水解，且顺序水解操作麻烦，耗时很长。由于两种酶最优工艺条件下的底物浓度分别为9%和12%，pH值分别为7.5和6，为此研究确定了底物浓度为9%时的较适pH值为7.5，此时的水解度、氨基态氮含量、多肽生成量及短肽得率分别为29.21%、27.29%、87.13 mg·g-1和57.24%；底物浓度12%时的较适pH值为6,此时各指标数值分别为 29.34%、26.42%、85.34 mg·g-1和55.96%，可见前者优于后者。虽对氨基态氮含量没有显著影响，但水解度显著高于风味蛋白酶单酶作用(p<0.05)，多肽生成量和短肽得率亦极显著高于单酶水解的67.75 mg·g-1和43.39%(p<0.01)。

陈晶等用复合蛋白酶与风味蛋白酶对鱼骨蛋白进行分步水解，可使水解度提高[4]，詹萍等优化了碱性蛋白酶和风味蛋白酶的分步水解羊骨的工艺[5]。本研究结果却表明分步水解即顺序水解对水解程度的增强作用没有同步水解强。这些研究者们仅仅考察了水解度一项指标，而本研究还考察了氨基态氮、多肽、短肽等多项指标，因此结果将更可靠。

以本研究确定的同步水解工艺水解羊骨粉，其多肽生成量和短肽得率比单酶水解的最大值分别提高了28.6%和31.9.%。短肽越多，羊骨胶原肽的生理活性将越强，研究证实，羊骨胶原肽具有防治骨质疏松、增强免疫、降血压等功能[6，7]，其它功能还有待进一步研究。

5结论

复合蛋白酶和风味蛋白酶顺序水解效果不及同步水解效果。双酶同步水解整体上由优单酶在最优工艺参数下的水解，且底物浓度9%、pH 7.5时的水解效果优于底物浓度12%、pH6时的水解效果。因此这两种酶本研究确定的复合水解条件为：骨粉添加量9%、复合蛋白酶添加量5%(E/S)、风味蛋白酶添加量为4.25%(E/S)、调节起始pH值为7.5，50 ℃水解315 min，此时的水解度为29.21%、氨基态氮含量为27.29%、多肽生成量为87.13 mg·g-1、短肽得率为57.24%，其中多肽生成量和短肽得率极显著地高于单酶水解的67.75 mg·g-1和43.39%(p<0.01)。

参考文献

[1]甄守艳,霍乃蕊,王凯,等. 碱性蛋白酶制备高水解度羊骨胶原肽的工艺研究[J].山西农业大学学报(自然科学版)，2015,35(6):655-659.

[2]史智佳,成晓瑜,陈文华,等. 牛骨蛋白酶解制备呈味肽工艺优化[J] .肉类研究,2010(2):37-38.

[3]林虬,黄薇,宋永康,等. 棉籽蛋白水解物水解度3种测定方法的比较[J].福建农业学报,2011,26(6):1077-1080.

[4]陈晶,刘友明,熊善柏,等.复合蛋白酶与风味蛋白酶分步水解鱼骨蛋白工艺的优化[J].华中农业大学学报, 2007,26 (5): 704-708.

[5]詹萍,张晓鸣,田洪磊,等. 二次旋转正交组合设计优化羊骨蛋白酶解工艺[J].食品工业科技,182-186,190.

[6]霍乃蕊,马俪珍,忻欣,等.羊骨酶解发酵液钙鳌合物对骨质疏松大鼠骨密度和骨代谢生化指标的影响[J].中国实验动物学报,2010,18(6):216-220.

[7]冯雅蓉,马俪珍.羊骨降血压肽制备工艺的研究[J].山西农业大学学报(自然科学版),2011,3l(3):253-256.

[8]甄润英,马俪珍,姜帆,等.羊骨胶原肽对实验性高血压大鼠血压和血脂的影响[J].营养学报,2008,30(5):512-519.

(编辑：马荣博)

Hydrolyzing of sheep bone powder using protamex and falvorzyme

Wang Yuhui1, Zhen Shouyan1, Huo Nairui2*, Zhang Qi1, Guo Juan1

(1．CollegeofFoodScienceandEngineering,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China; 2．CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China)

Abstract:Protamex and flavorzyme were used sequentially or simultaneously to further improve the degree of hydrolyzing of sheep bone powder and to determine the better pattern and condition for hydrolyzing. Results suggested that simultaneous pattern was better than sequential pattern. 9% bone powder at pH 7.5 was better than 12% at pH 6. Hence the determined pattern for double-protease hydrolysis of sheep bone powder was simultaneous style and the condition was 9% substrate, 5%(E/S) protamex, 4.25%(E/S) flavorzyme, pH 6，50 ℃, 315min. Under this condition, the degreee of hydrolysis, amount of amino-acid nitrogen, reached to 29.21% and 27.29%. The amount of formed polypeptides and the obtaining rate of oligopeptides reached to 87.13 mg·g-1and 57.24% respectively which is extremely higher than 67.75 mg·g-1and 43.39% of single-enzyme pattern(P<0.01).

Key words:Protamex; Flavorzyme; Simultaneous hydrolyzing; Sequential hydrolyzing; Ossein peptide

中图分类号：TS251.94

文献标识码：A

文章编号：1671-8151(2016)01-0057-04

基金项目：国家自然科学基金(31201347)、山西省回国留学人员项目(2014-042)

通讯作者：*霍乃蕊，博士，教授。Tel：13935452616 ；E-mail:tgnrhuo@163.com

作者简介：王钰慧(1989-)，女(汉)，山西万荣人，硕士研究生，研究方向：食品生物技术

收稿日期：2015-11-16修回日期：2015-11-27