维药阿魏提取物阿魏酸在小鼠银屑病样皮肤损害中保护作用的研究

于均峰，尚佩生，张文娟，沈晓峰

（新疆医科大学第五附属医院，乌鲁木齐830001）

·论著·

维药阿魏提取物阿魏酸在小鼠银屑病样皮肤损害中保护作用的研究

于均峰，尚佩生，张文娟，沈晓峰

（新疆医科大学第五附属医院，乌鲁木齐830001）

目的研究维药阿魏提取物在咪喹莫特银屑病动物模型中的保护作用。方法将实验动物BALB/c小鼠随机分为空白对照组、模型对照组、阿魏酸高、中、低剂量组及咪喹莫特阳性对照组，每组10只，采用PASI评分及皮肤组织病理分析各实验组的皮损变化及组织病理改变，此外，采用ELISA方法检测动物外周血血清中白细胞介素（IL）-2、肿瘤坏死因子（TNF）-α含量的变化。结果咪喹莫特模型组的皮肤PASI评分结果与空白对照组、地奈德对照组及高浓度阿魏酸实验组相比差异有统计学意义，高浓度阿魏酸组皮肤组织TNF-a、IL-2的含量与咪喹莫特组相比差异有统计学意义（P＜0．05），与空白对照组相比差异无统计学意义。结论咪喹莫特可以引起BALB/c小鼠皮肤出现银屑病样的改变，高浓度的阿魏酸对银屑病样的皮损有一定的保护作用。

阿魏酸；咪喹莫特；白细胞介素-2;肿瘤坏死因子-α

银屑病是一种常见的多基因遗传、多环境因素诱导的慢性炎症性增殖性皮肤病[1-2]，欧美患病率约2～3%[3]。我国流行病学调查发现其人群患病率约0．123%[4]。银屑病易复发，治疗困难，病程长，是我国北方地区常见的皮肤病[5]。主要的病理改变为角质增厚，角化不全，属于中医“白疕”范畴[5-6]。中医学认为银屑病的病因病机为血热内蕴、阴血耗伤，生风致燥，肌肤失养，则起白屑，近年来我国北方各省巿流行病学调査发现其患病率为较年前有明显上升。银屑病的治疗方法有很多种，包括局部外用治疗、光照治疗以及系统药物治，以及近年来兴起的各种生物制剂[7]，这些治疗方法均具有一定的优缺点，而且长期应用费用高昂，尤其是生物制剂医疗费用更高，而新疆多地区民间有用阿魏根溶液外敷治疗银屑病的传统，阿魏是新疆地区特有的医药资源，在维医中具有重要的地位，而阿魏提取物治疗银屑病的效果未有正式的研究报道。本实验拟通过动物实验研究阿魏主要提取物阿魏酸在咪喹莫特银屑病动物模型中的保护作用，为进一步研究阿魏酸的作用机制及开发治疗银屑病的新型外用制剂提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物选择雌性BALB/c小鼠，18～20 g，购自新疆医科大学动物实验中心，SPF级别，咪喹莫特乳膏（四川明欣药业有限责任公司，5%），地奈德乳膏（四川华邦制药有限公司），阿魏酸（阿拉丁公司，#L1411067）。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的制作及临床评分标准 将BALB/c小鼠用戊巴比妥钠80 mg/kg腹腔注射麻醉后用电动剃刀剃除其背部毛发，形成约2 cm×3 cm大小的暴露区域，适应性饲养1周后进入实验。将实验动物随机分为正常对照组、咪喹莫特模型组和地奈德乳膏治疗组及阿魏酸实验组（以DMSO溶解阿魏酸配制1%，2%，5%3个浓度），每组10只小鼠。咪喹莫特模型组是将5%（质量分数）咪喹莫特软膏（62.5 mg）每日上午10时均匀的涂抹于小鼠背部皮肤7 d诱导银屑病，空白对照组给予同等剂量的凡士林软膏，1次/d，连续8 d，地奈德乳膏治疗组于上午10时受试部位涂抹咪喹莫特乳膏，下午5时涂抹地奈德乳膏，1次/d；阿魏酸各实验组是用涂抹咪喹莫特乳膏后8 h内用微量移液器将100 μL不同浓度的溶液均匀的涂抹小鼠背部，2次/d。临床症状采用银屑病面积与严重程度指数（Psoriasis area and severity index，PASI）评分标准，从红斑、鳞屑、皮肤厚度3项指标进行评价，以0～4分进行记分，将3者积分相加得到总积分。PASI评分标准如下：0，无症状；1，轻度；2，中度；3，重度；4，极重度。皮损评分采用两名观察者双盲法进行评判。

1.2.2 组织病理学检查 颈椎脱臼处死小鼠后用6 mm皮肤采样器取背部皮肤损伤处组织，各组皮肤组织采用10%（质量分数）甲醛溶液固定，石蜡包埋，行6 μm切片，进行常规HE染色，分别于100倍及400倍率下观察皮肤组织病理变化。

1.2.3 ELISA法检测外周血清中肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素（IL-2）的含量 小鼠处死前用眼科剪剪去小鼠眼部毛发，采用摘除眼球取血法，3 000转/分离心5 min取上清备用，外周血清中的TNF-α、IL-2的含量测定采用酶联免疫吸附实验方法检测，具体实验步骤见试剂盒说明书，通过标准品绘制标准曲线，计算出标准品的线性回归曲线，按曲线方程计算各样本的浓度值，最终浓度为实际测定浓度乘以原液的稀释倍数。

1.3 统计学分析 数据录入到Excel数据库中，用SPSS12.0软件进行分析，所有计量资料均以（s）表示，各组间检测指标的差异用单因素方差分析，分析前进行方差齐性检验，方差分析采用LSD法比较各组均数与对照组间的差异。

2 结果

2.1 动物实验皮损改变病情况及PASI评分 实验过程中按照据PASI评分标准进行评价，各组实验动物背部皮损评分结果见表1所示，实验组涂抹给予咪喹莫特乳膏2～3 d后背部皮肤开始出现轻度水肿、皮肤增厚；3～4 d后受试皮肤出现轻微结痂和鳞屑，增厚现象出现较迟，随着时间的推移，实验组小鼠皮肤损伤日益严重，皮肤增厚明显，毛发不整齐，甚至出现少数斑块状鳞屑，第7天时，与正常对照组小鼠相比，模型组小鼠皮肤红斑现象明显，皮肤明显增厚，表面粗糙，毛发凌乱不整。治疗组及不同浓度的阿魏酸组小鼠皮损与同期模型组相比红斑色浅，鳞屑稀少，皮肤较光滑，增厚现象较轻，皮损症状有明显的改善，见图1，各项指标PASI评分都低于同期模型组小鼠，见表1。各组皮损PASI评分比较差异有统计学意义（P<0.05），治疗组与各阿魏酸实验组受试皮肤损害较轻。

图1 各实验组小鼠背部皮肤

表1 BALB/c小鼠银屑病模型各实验组PASI评分

2.2 病理学改变 HE染色结果显示，空白对照组小鼠皮肤组织病理未见明显异常，与空白对照组比较，阳性对照组小鼠表皮层表皮增厚，出现角化不全，颗粒层减少，棘层肥厚，角质层内残留有固缩的细胞核，表皮突向下延伸呈棒槌状改变，真皮可见炎性细胞浸润，毛细血管扩张及扭曲，阿魏酸组与模型组相比有明显差异，表皮角质层无明显增厚，角化不全较少，表皮突形态接近正常。地奈德乳膏治疗组组织病理改变与空白对照组相比差异较小。见图2。

图2 各实验组皮肤组织病理改变（HE染色×100）

2.3 小鼠模型血清中TNF-α、IL-2含量的测定 小鼠外周血离心后用酶联免疫吸附实验方法检测血清中TNF-α、IL-2含量的含量，经SPSS统计分析各组方差齐性检验无统计学意义（P＞0．05），咪喹莫特组、1%阿魏酸组、2%阿魏酸组的TNF-α、IL-2含量与空白对照组相比差异均有统计学意义（P＜0．05），地奈德组、5%阿魏酸组的TNF-α、IL-2含量与咪喹莫特对照组相比差异均有统计学意义（P＜0．05）。1%、2%阿魏酸组的TNF-α、IL-2含量与咪喹莫特组相比差异无统计学意义，见表2。

表2 各实验组小鼠皮肤组织中TNF-α、IL-2的含量

3 讨论

银屑病是一种以红斑、丘疹、鳞屑为特征的慢性炎症性免疫性疾病，以表皮过度增殖和真皮慢性炎症反应为特征。新疆银屑病的发病率居于全国前列，而新疆南疆地区很早就有用阿魏根药水治疗寻常型银屑病的方法，我科曾对部分皮损分布特点及病情接近的寻常型银屑病住院患者采取阿维魏粉通过医院制剂室制成外用药膏后封包治疗，临床效果与卡泊三醇软膏治疗疗效相近。

阿魏是产于新疆地区的特色中药材，中华人民共和国药典（1990年版） 记载：新疆阿魏（eFurlasikiangensisK．M．shen） 和 阜 康 阿 魏（eFrulafukanensisK．M．hsen）2种均产于新疆。阿魏在维吾尔医药中具有悠久的应用历史，具有截疟、止痢、解毒、消积、杀虫、祛痰和活血等功能，阿魏提取物种类较多，主要包含挥发油、树脂及树胶、阿魏酸等化学成份[8-9]，阿魏酸（Ferulic acid）是阿魏的有效成分之一，具有多方面的生物活性，如抗血小板聚集、降血脂、抗血栓、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、毒性低等特点[10-11]，目前阿魏酸在心血管疾病、肿瘤、肝脏疾病及免疫反应方面的研究国内外有许多报道[12]。多数维药在中国仅新疆有大量分布，药用资源独特，为进一步发掘新疆地区的特色医药资源，我们采用整体动物银屑病模型[13-14]对维药阿魏根主要成分阿魏酸在银屑病中的作用进行初步的基础研究，为进一步研究阿魏提取物的皮肤科药用价值奠定基础。通过咪喹莫特银屑病模型的实验研究，笔者发现不同浓度的阿魏酸溶液对银屑病样皮损有一定的保护作用，相比较阳性对照，保护组的皮损反应明显减弱，与空白对照组相比差异无统计学意义，通过受试部位皮肤组织病理改变，笔者发现阳性对照组表皮厚度增加，棘层肥厚，角化过度明显，真皮乳头层有血管扩张，符合银屑病的典型病理改变，而高浓度的阿魏酸组与地奈德治疗组的组织病理与空白对照组相比差异无统计学意义。许多文献表明阿魏酸具有明显的抗炎作用，可能通过降低皮损部位的炎症反应发挥保护作用，为此笔者选择在银屑病的发病作用中具有重要作用的细胞因子TNF-α、IL-2作为初步研究的实验指标，通过不同组间TNF-α、IL-2含量的方差分析，实验发现高浓度阿魏酸组的细胞因子含量与阳性对照组相比差异有统计学意义，而与空白对照组相比差异无统计学意义，表明阿魏酸能降低银屑病样皮损中细胞因子的含量，而具体作用机制有待于进一步研究。本课题组拟进一步检测小鼠皮肤组织中IL-22、IL-23、IL-17的含量、外周血中淋巴细胞亚群数量的变化及皮肤组织中角质形成细胞过度增殖及异常分化的相关指标进一步探讨免疫功能异常在小鼠银屑病样皮炎发病中的作用机制。

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Protective Effect of the Ferula Extract in Psoriasis-like Skin Injury of the BALB/c Mice

Yu Junfeng,Shang Peisheng,Zhang Wenjuan,Shen Xiaofeng
The fifth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University,Urumchi 830011,China

ObjectiveIn order to investigate the protective effect and mechanism of Ferula acid for mice psoriasis models．MethodsAll the BALB/c mice were randomly divided into normal control group,model group,Ferula acid high dosage group,Ferula acid middle dosage group,Ferula acid low dosage group,and positive control group．The PASI scores and the change of skin histopathology were observed,and the levels of serum IL-2 and TNF-α were detected．ResultsThe PASI scores of skin in the blank control group were significantly deferent compared with positive control group and Ferula acid low dosage group．The levels of serum IL-2 and TNF-α of the positive group were significantly higher compared with Ferula acid high dosage group (P＜0．05)．ConclusionImiquimod cream could induced psoriasis-like skin injure in the BALB/c mice．Ferula acid has the protective effect on the psoriasis-like skin injure．

Ferula acid;Imiquimod;Interleukin-2;Tumor necrosis factor-α

R758．63

A

1672－0709（2016）06-0336－04

2016-03-01）

沈晓峰，E-mail:lzx4314643@sina.com