肝细胞癌组织中IL-18BPc和VEGF的表达及与肿瘤血管形成的关系

查翔远，翟群超，吴建成，宋有良，吴同生，叶珍珠，汪泽华

(铜陵市人民医院1.感染科；2.内分泌科，安徽 铜陵　244000；

3.苏州大学附属第一医院感染科，江苏 苏州　215006)



肝细胞癌组织中IL-18BPc和VEGF的表达及与肿瘤血管形成的关系

查翔远1，翟群超2，吴建成3，宋有良1，吴同生1，叶珍珠1，汪泽华1

(铜陵市人民医院1.感染科；2.内分泌科，安徽 铜陵244000；

3.苏州大学附属第一医院感染科，江苏 苏州215006)

摘要：目的探讨IL-18BPc和VEGF在原发性肝细胞癌组织中的表达及其与肿瘤血管形成之间的关系。方法应用免疫组织化学SP法检测IL-18BPc和VEGF在34例肝细胞癌组织、34例癌旁肝组织及12例正常肝组织的表达，通过CD34免疫组织化学染色评价肿瘤组织MVD值，分析IL-18BPc表达与VEGF表达及MVD的关系。结果IL-18BPc在肝癌组织中的表达阳性率高于癌旁肝组织(P<0.01)及正常肝组织(P<0.01)，且肝癌出现侵袭转移者较未出现侵袭转移者其IL-18BPc表达阳性率高(P<0.01)；VEGF在肝癌组织中的表达高于癌旁肝组织(P<0.01)及正常肝组织(P<0.01)；IL-18BPc和VEGF在肝细胞癌中表达呈正相关(r=0.357,P=0.037)；肝癌组织MVD值与高于癌旁肝组织(P<0.01)及正常肝组织(P<0.01)；肝癌组织中， IL-18BPc阳性表达者MVD值高于阴性表达者(P=0.004)。结论IL-18BPc可能通过上调VEGF的表达促进肝细胞癌血管形成。

关键词:肝细胞癌；血管生成；白介素-18；结合蛋白；血管内皮生长因子；微血管密度；免疫组织化学

Expression of IL-18BPc and VEGF in hepatocellular carcinoma

and its relationship with tumor angiogenesis

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是常见的恶性肿瘤之一，约占国内全部癌症发病率的10%。恶性肿瘤最显著的特点是肿瘤细胞的失控性生长及异常血管增生。HCC易发生侵袭转移，血管形成是其生长、浸润及转移的关键步骤。近年研究提示白介素-18(interleukin-18，IL-18)具有抑制肿瘤作用[1-3]，而其内源性抑制物白介素-18结合蛋白(interleukin-18 binding protein, IL-18BP)通过活化VEGF/Akt信号途径和促进骨髓来源内皮祖细胞(BM-EPCS)的动员和分化刺激新生血管生成[4]。IL-18BP基因至少编码4种不同的同型体[5]，IL-18BPc是有生物学活性的IL-18BP之一。本研究通过免疫组织化学技术检测HCC组织中IL-18BPc、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的表达情况，根据CD34染色的血管内皮细胞计数肿瘤微血管密度(microvessel density, MVD)，分析IL-18BPc表达与VEGF表达及MVD的关系，旨在探讨IL-18BPc在HCC血管形成中的作用。

1材料与方法

1.1研究对象收集2004年9月至2007年9月苏州大学附属第一医院肝胆外科经手术切除并经病理证实的HCC患者34例，所有患者术前均未行放疗或化疗。其中男25例，女9例，年龄23～61岁，平均年龄为42.8岁。留取34例患者HCC组织及配对癌旁肝组织(距离肿块边缘≥2 cm处肝组织)标本，正常肝组织12例取材于同期胆囊结石手术患者。

1.2试剂来源兔抗人IL-18BPC-C多克隆抗体由苏州大学附属第一医院感染科实验室通过IL-18BPC-C端多肽免疫新西兰兔制备，兔抗人VEGF多克隆抗体购于武汉博士德生物公司，鼠抗人CD34单克隆抗体购于北京中山生物技术公司，即用型SP试剂盒(抗鼠/兔)、DAB显色试剂盒购于福州迈新生物技术公司。

1.3方法采用免疫组织化学法(SP法)，DAB显色，苏木精对比染色。一抗IL-18BPc、VEGF、CD34工作液浓度分别为1∶500、1∶100、1∶100；阳性对照采用试剂公司提供的阳性石蜡切或预试验阳性标本，阴性对照以PBS代替一抗。染色步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.4IL-18BPc及VEGF阳性结果判定免疫反应阳性染色主要位于胞质中，呈棕黄色或棕褐色颗粒。采用半定量积分法判断阳性结果[6]：于200倍镜下随机选择3个视野，根据每张切片的阳性细胞百分率及着色强度计分:着色细胞占计数细胞百分率<33.3%计1分，33.3%～66.7%计2分，>66.7%计3分；着色强度：基本不着色计0分，淡黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分。计算每张切片着色细胞百分率得分和着色强度乘积(取3个视野的平均值)，按其最后得分判断：≤1分为阴性(-)，>2分为阳性(+)。

1.5MVD计数单个或成簇血管内皮细胞染成棕色或棕黄色即为CD34阳性染色。参考文献[7]的方法，先低倍镜下扫查整个切片，寻找血管高密度区。再在×200倍视野下，取5个高倍视野内的微血管数的平均值为MVD值。

1.6统计学方法数据经SPSS16.0软件进行统计分析。率等计数资料的组间比较的比较，采用χ2检验或Fisher确切概率法，相关性分析应用Pearson相关检验，多组间计量资料比较为one way ANOVA检验，两两组间比较为LSD-t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1IL-18BPc、VEGF在肝癌组织、癌旁肝组织及正常肝组织中的表达情况IL-18BPc阳性呈棕黄色或棕褐色颗粒，位于胞质(图1)。IL-18BPc在肝癌组织、癌旁肝组织及正常肝组织中表达阳性率分别为85.3%(29/34)、38.2%(13/34)及0(0/12)。IL-18BPc在肝癌组织中表达高于癌旁及正常肝组织(P<0.01)。IL-18BPc在癌组织中、癌旁肝组织及正常肝脏组织中表达的半定量评分值分别为(4.0±1.6)、(1.6±1.3)及(0.5±0.5)，组间比较，差异有统计学意义(P<0.01)。且三组间两两比较，差异均有统计学意义(P<0.01)。

VEGF阳性呈棕黄色颗粒，位于胞质(图2)。VEGF在肝癌、癌旁肝组织及正常肝组织中表达阳性率分别为76.5%(26/34)、32.4%(11/34)和16.7%(2/12)。经χ2检验，VEGF在肝癌组织中表达高于癌旁肝组织及正常肝组织(P均<0.01)。

2.2肝癌组织、癌旁肝组织及正常肝组织中MVD情况34例肝癌组织及癌旁组织MVD值分别为(50.3±11.1)/200倍视野(图3)和 (13.8±6.0)/200倍视野，正常肝组织中无CD34阳性表达。肝癌组织中MVD值明显高于癌旁肝组织及正常肝组织(P均<0.01)。

2.3HCC癌组织中IL-18BPc与MVD之间关系HCC癌组织中，IL-18BPc阳性表达者及IL-18BPc阴性表达者MVD值分别为(52.4±10.4)/200倍视野和(37.9±6.7)/200倍视野，两者比较差异有统计学意义(P=0.004)。

2.4HCC癌组织中IL-18BPc与VEGF表达之间关系HCC癌组织中IL-18BPc表达与VEGF表达行Pearson相关性检验，显示IL-18BPc与VEGF之间呈正相关(r=0.357,P=0.037)。

2.5IL-18BPc表达与HCC临床参数间的关系HCC组织中IL-18BPc表达与肿瘤是否发生转移有关(P=0.006)，而与患者年龄、性别、肿瘤大小、AFP值的高低、伴肝硬化或乙肝表面抗原阳性与否及肿瘤分化情况无关，见表1。

表1　IL-18BPc表达与HCC临床病理特征之间的关系

注:*Fisher’s 确切概率法。

图1　IL-18BPc在HCC癌组织中表达(免疫组化×200)

图2　VEGF在HCC癌组织中表达(免疫组化×200)

图3　CD34在HCC癌组织中表达(免疫组化×100)

3讨论

目前认为，IL-18不但在诱导T细胞和NK细胞产生IFN-γ方面发挥着关键性作用[8]，在肿瘤免疫及抗血管生成中也有重要影响[9]。动物实验显示IL-18可抑制HepG2肝癌裸鼠皮下移植瘤形成及转移[10]，应用表达IL-18的鼠伤寒杆菌减毒株在鼠肿瘤模型中显示出明显的抗肿瘤活性[11]，外源性给予IL-18处理的肿瘤表现出血管生成低下，微血管密度减少，提示IL-18有抗血管生成的作用[12]。

作为IL-18的内源性抑制物，研究显示用IFN-γ处理的前列腺癌细胞可分泌IL-18BP以中和IL-18的抗肿瘤效应[13]，有学者认为肿瘤细胞分泌IL-18BP增加在于试图逃避免疫监视[14]；原发性肝癌患者血清IL-18BP浓度明显高于肝硬化患者，随着肝癌进展，其浓度增高，血清IL-18BP水平明显增高可能与肝癌患者免疫功能低下及更晚的肿瘤分期有关[15]；杨汉正等[16]报道肝癌癌周组织及癌组织大量表达IL-18BP，提示IL-18BP有促进肿瘤生长的作用。本研究通过免疫组化法检测HCC组织中IL-18BPc表达情况，结果显示IL-18BPc在HCC癌组织中表达阳性率明显高于癌旁肝组织及正常肝组织，且发生肿瘤侵袭转移的HCC癌组织IL-18BPc表达阳性率明显高于未发生肿瘤侵袭转移的HCC癌组织，提示IL-18BPc表达可能与肿瘤侵袭转移有关。本研究还发现HCC组织中IL-18BPc表达与患者年龄、性别、肿瘤大小、AFP值的高低、伴肝硬化或乙肝表面抗原阳性与否及肿瘤分化情况无关。

VEGF是一种具有生物功能的血管源性肽，包括调节造血干细胞的发育、细胞外基质的重塑和炎性细胞因子的再生，被认为是刺激血管内皮细胞增殖最重要的细胞因子之一[17]，也是肝细胞癌重要的肿瘤标记物[18]。VEGF相关信号传导通路由VEGF超家族、VEGF受体及其他信号蛋白和核内转录调节因子组成，VEGF通过与其受体结合，使受体磷酸化激活细胞内信号传导通路而实现促进血管生成作用，对细胞恶变、肿瘤发生、发展和侵袭转移起调控作用[19]。本研究显示，VEGF在HCC癌组织中表达阳性率也明显高于癌旁肝组织及正常肝组织，且HCC癌组织中IL-18BPc和VEGF表达呈正相关，提示IL-18BPc可能通过上调VEGF的表达促进HCC血管形成，从而参与调控肿瘤侵袭转移。

CD34作为肿瘤新生血管标志物，在包括肝细胞癌[7]、骨恶性肿瘤[20]在内多种肿瘤组织中小血管都有表达。本研究显示，CD34在肝癌组织及癌旁组织中呈均有表达，而在正常肝组织中呈阴性。肝癌组织中MVD计数明显高于癌旁肝组织及正常肝组织，且肝癌组织中IL-18BPc阳性表达者MVD计数明显高于IL-18BPc阴性表达者，进一步提示IL-18BPc的表达可能促进肝癌新生血管形成。

综合以上情况，我们认为IL-18BPc可能通过上调VEGF的表达促进肝癌血管形成，影响肿瘤的生长和侵袭转移；另一方面与IL-18结合，抑制其发挥抗肿瘤及抗血管生成活性，且下调IFN-γ表达，促进肿瘤生长。当然，原发性肝癌的发生、发展及侵袭转移并不是单一因素所致，而IL-18BPc可能是影响HCC血管形成的因素之一，但其确切的作用机制值得进一步研究。

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ZHA Xiang-yuan1, ZHAI Qun-chao2, WU Jian-cheng3, et al

(1.DepartmentofInfectiousDiseases;2.DepantmentofEndocrinology,TonglingPeople'sHospital,

Tongling244000,China;3.DepartmentofInfectiousDiseases，

TheFirstHospitalAffiliatedtoSuzhouUniversity，Suzhou245006，China)

Abstract:Objective To detect IL-18BPc and VEGF expression in hepatocellular carcinoma (HCC) and to investigate the relationship of this expression with tumor angiogenesis.Methods IL-18BPc and vascular endothelial growth factor (VEGF) expressions in 34 specimens of HCC, 34 specimens of adjacent non-tumorous liver tissue, and 12 specimens of normal liver tissue were detected by immunohistochemistry. Microvessel density (MVD) was determined by labeling the vascular endothelial cells with cluster of differentiation 34(CD34). Correlation between the expression of IL-18BPc and VEGF in HCC tissue was analysed. Results The expression of IL-18BPc protein in HCC tissue was significantly higher than that in adjacent non-tumorous liver tissue(P<0.01) and normal liver tissue(P<0.01), moreover, this expression was related to tumor metastasis in HCC. The expressions of VEGF protein and CD34 in PHC tissue were significantly higher than those in adjacent non-tumorous liver tissue(P<0.01) and normal liver tissue(P<0.01). IL-18BPc expression in HCC tissue was positively correlated with VEGF expression(r=0.357,P=0.037). MVD of specimens with IL-18BPc positive expression was significantly higher than those with IL-18BPc negative expression in HCC tissue(P=0.004). Conclusions IL-18BPc possibly promotes tumor angiogenesis through upregulation of VEGF expression in HCC.

Key words:hepatocellular carcinoma;angiogenesis;interleukin-18 binding protein;VEGF;MVD;immunohistochemistry

收稿日期：(2015-10-12，修回日期：2015-12-07)

通信作者:吴建成，男，主任医师，硕士生导师，研究方向:病毒性肝炎的基础与临床研究，E-mail: xywjc370@126.com

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.01.023