高效液相色谱法测定木瓜水溶性有机酸含量的样品处理方法研究

况作品，周亚菁，谢晓梅，查日维，杨　沫

(安徽中医药大学药学院，现代中药安徽省重点实验室，安徽 合肥　230012)



高效液相色谱法测定木瓜水溶性有机酸含量的样品处理方法研究

况作品，周亚菁，谢晓梅，查日维，杨沫

(安徽中医药大学药学院，现代中药安徽省重点实验室，安徽 合肥230012)

摘要：目的优化木瓜水溶性有机酸含量测定的样品处理方法。方法采用经验证的高效液相色谱法，以苹果酸、莽草酸、绿原酸、原儿茶酸、奎尼酸、咖啡酸含量为评判指标，用单因素试验法考察提取方式(回流和超声提取)，乙醇浓度和料液比对有机酸提取量的影响；提取后经净化、富集；用流动相中的水相溶解、进样分析。结果样品最佳处理方法为50%乙醇、料液比为1∶20、超声提取60 min；在此条件下，木瓜有机酸提取量较高，非酸性成分干扰较少。色谱图基线平直，6种水溶性有机酸的色谱峰对称性和分离度良好。结论该方法能有效提取样品中水溶性有机酸，降低HPLC分析中的基质效应，可为木瓜有机酸含量测定提供稳定可靠的供试品溶液制备方法。

关键词：木瓜；有机酸；样品处理；测定；高效液相色谱法

中药木瓜为蔷薇科植物贴梗海棠Chaenomelesspeciosa(Sweet) Nakai的干燥近成熟果实，归肝、脾经，具有舒筋活络，和胃化湿的功效[1]。木瓜中含有丰富的有机酸成分，传统评价药用品质的标准是“味酸者为佳”[2]。药理学研究表明有机酸药理作用广泛，是抗炎镇痛、抑制血小板聚集、抗血栓及诱导肿瘤细胞凋亡的活性成分[3-5]。木瓜有机酸成分群含有脂溶性和水溶性有机酸[6]。脂溶性的三萜酸测定有较多文献报道，齐墩果酸和熊果酸已被《中国药典》收载为木瓜含量测定项下的指标成分[1]；但作为木瓜有机酸重要组成部分的水溶性有机酸测定的文献较少，未见样品中6种水溶性有机酸能同时被检测到的报道[7-8]。有机酸成分的测量方法有气相色谱法、液相色谱法和毛细管电泳法以及与质谱联用等方法。气相色谱法一般需要将有机酸衍生化方可分离检测[9]。HPLC法可用离子交换色谱和反相色谱分离[10-12]；但色谱图峰形和分离度常不理想[13]。课题组前期研究发现，木瓜水溶性有机酸组成的类别较为复杂，有一元酸和多元酸，脂肪酸和芳香酸；且含量高低差别较大；因为水溶性，在提取时共存的干扰物较多；采用HPLC法测量的主要困难在样品前处理和液相色谱分离条件选择上。本文对木瓜中有机酸测定的样品前处理进行了单因素试验，利用已建的反相液相色谱法，以苹果酸、莽草酸、原儿茶酸、绿原酸、奎尼酸、咖啡酸含量为评判指标，考察提取方式、乙醇浓度和料液比对有机酸提取量的影响；采用溶剂萃取对提取物净化、富集；用酸化水溶解萃取物。旨在为木瓜中水溶性有机酸成分分析提供有效的样品处理方法。

1仪器与试药

Agilent1260高效液相色谱仪(包括G1312C二元泵，G1316B二极管阵列检测器，G1316A柱温箱和 chemstation色谱工作站)；BP211D电子天平(十万分之一，德国赛多利斯公司)；pHS-3CA精密酸度计(上海大普仪器有限公司)；Milli-QAdvantage超纯水机(美国Millipore公司)；KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。

奎尼酸(批号：130509，四川维克奇生物科技有限公司)、苹果酸(批号 ：20120201，国药集团化学试剂有限公司)和莽草酸(批号：15-2001，上海中药标准化研究中心)的纯度>98%，原儿茶酸(批号 ：110809-200604)、绿原酸(批号：110753-200413)和咖啡酸(批号 ：110885-200102)由中国食品药品检定研究院提供，均为含量测定用。乙腈为色谱纯，水为纯化水，其他试剂均为分析纯。宣木瓜采自安徽宣城宣木瓜产地，经安徽中医药大学药学院彭华胜教授鉴定为Chaenomelesspeciosa(Sweet) Nakai果实。用前干燥、粉碎(过40目筛)备用。

2方法与结果

2.1对照品溶液的制备精密称取奎宁酸、苹果酸、莽草酸、原儿茶酸、绿原酸和咖啡酸对照品适量，用流动相A(0.5%磷酸二氢铵溶液，用磷酸调节pH值至2.2)溶解并定容，制成质量浓度分别为每1 mL含奎宁酸0.236 mg、苹果酸0.630 mg、莽草酸0.226 mg、原儿茶酸0.254 mg、绿原酸0.214 mg、咖啡酸0.206 mg的对照品储备液；分别精密量取1 mL储备液置10 mL量瓶中，以流动相A稀释至刻度，得混合对照品溶液。

2.2色谱条件[14-15]和系统适用性试验色谱柱：Ultimate AQ-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相A：0.5%磷酸二氢铵溶液(用磷酸调节pH值至2.2)，流动相B：乙腈，梯度洗脱：0～7 min，100% A，7～15 min，100%～92% A，15～25 min，92% A，25～35 min，92%～85% A，35～40 min，85% A，40～45 min，85%A～100%A；检测波长：0～7 min为210 nm，7～25 min为260 nm，25～45 min为325 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃。奎尼酸、苹果酸、莽草酸、原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸色谱峰与其相邻色谱峰的分离度均大于1.5，拖尾因子在0.95～1.00之间，理论塔板数以苹果酸计大于10 000。色谱图见图1。

混合对照品木瓜样品

图1 HPLC图

注：1.奎尼酸 2.苹果酸 3.莽草酸 4.原儿茶酸 5.绿原酸 6.咖啡酸。

2.3样品处理试验

2.3.1提取方式(1)超声提取：取药材粉末2.0 g，精密称定，加30%乙醇20 mL，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)60 min，滤过，滤液减压浓缩至无醇味，盐酸酸化至pH=2.0，再以等体积正丁醇萃取2次，合并萃取液，减压回收溶剂，残渣加流动相A溶解并定容至10 mL，滤过，得供试品溶液。平行2份。

(2)回流提取：取药材粉末2.0 g，精密称定，加30%乙醇20 mL，80℃水浴回流1 h，余下同“超声提取”项下超声提取法。平行2份。取对照品溶液和不同提取方式制得的供试品溶液，按2.2项下色谱条件进样，外标法计算各有机酸含量，结果见图2。显示超声提取方式较好。比较超声30 min和60 min，显示60 min 提取效果较好。

图2　提取方式对木瓜有机酸提取量的影响

2.3.2乙醇浓度取药材粉末2.0 g，精密称定，分别精密加入水，10%乙醇，30%乙醇，50%乙醇，70%乙醇各20 mL，按“超声提取”项下方法制备供试品溶液，各类溶剂平行2份。取对照品溶液和各供试品溶液，按2.2项下色谱条件进样，外标法计算各有机酸含量，结果见图3。显示50%乙醇提取较好。

图3　乙醇浓度对木瓜有机酸提取量的影响

2.3.3料液比取药材粉末2.0 g，精密称定，分别按料液比1∶8，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25精密加入50%乙醇，按“超声提取”项下方法制备供试品溶液，每一料液比平行2份。取对照品溶液和各供试品溶液，按2.2项下色谱条件进样，外标法计算各有机酸含量，结果见图4。显示1∶20料液比提取较好。

图4　料液比对木瓜有机酸提取量的影响

依据木瓜水溶性有机酸提取条件试验，确立最佳样品处理方法为：取木瓜药材粉末2.0 g，精密称重，置具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇40 mL，超声处理60 min，滤过，滤液减压浓缩至无醇味，盐酸酸化至pH = 2.0，加等体积正丁醇萃取2次，合并萃取液，减压回收溶剂，残渣加流动相A溶解并定容至10 mL，过0.45 μm微孔滤膜，即得供试品溶液。

2.4验证性试验取木瓜药材粉末，按照最佳样品处理方法制备供试品溶液，平行3份；取对照品溶液和各供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样，外标法计算各有机酸含量，结果见表1。

表1　木瓜水溶性有机酸提取方法

验证性实验结果表明，所建方法对6种脂肪族和芳香族有机酸测定的重复性良好，方法有效可行，适用于木瓜中这些水溶性有机酸HPLC测定的样品处理。

3讨论

本试验中测定的水溶性有机酸奎尼酸(分子量192)、苹果酸(分子量134)和莽草酸(分子量174)是脂肪酸，原儿茶酸(分子量154)、绿原酸(分子量354)和咖啡酸(分子量180)是酚酸；含量最高的是苹果酸，约为最低含量咖啡酸的1 000倍。通过建立的样品处理方法，结合对极性组分具有较强保留的AQ-C18色谱柱和波长切换技术，较好完成了在结构和含量存在较大差异的木瓜6种水溶性有机酸成分群的同时测定。

由图2～4可知，提取方式、乙醇浓度、料液比对木瓜中奎尼酸、苹果酸、莽草酸提取量影响较大，对原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸影响较小。在提取方式上超声比回流提取率高，原因可能是回流加热过程导致部分有机酸被破坏；在提取溶剂甲醇或乙醇的使用上，考虑后续溶剂处理操作的安全性，选择了毒性较小的乙醇；通过比较不同浓度乙醇提取与纯水提取，发现这些水溶性有机酸在50%乙醇中被提取的更多。水溶性有机酸提取后，药渣中仍存在一些非水溶性有机酸成分，合理利用药渣也是对木瓜有机酸研究的重要部分。

实验中分别考察了醇提取后碱化再酸化和醇提后直接酸化萃取对有机酸提取量的影响， 色谱分析结果显示两种方法的差异不明显；但前者操作步骤较多，所得结果平行性较差，故采用醇提后直接酸化萃取的方法。在萃取溶剂种类上，分别考察了乙酸乙酯、正丁醇萃取对有机酸纯化的影响，结果显示有机溶剂萃取均起到净化除杂和富集的作用，正丁醇萃取所得6种有机酸总含量明显高于乙酸乙酯萃取。在萃取物溶解上，分别考察了甲醇、水和流动相A不同溶剂。结果显示，以酸性电解质水溶液为溶剂，对改善奎宁酸、苹果酸、莽草酸的色谱峰峰形和分离度较为有利，6种水溶性有机酸得以很好的分离与测定。

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Sample processing method for determination of water soluble

organic acids in Chaenomelis Fructus by HPLC

KUANG Zuo-pin，ZHOU Ya-jing，XIE Xiao-mei，et al

(SchoolofPharmacy，AnhuiUniversityofChineseMedicine，

AnhuiKeyLaboratoryofModernChineseMateriaMedica，Hefei,Anhui230012，China)

Abstract:Objective To optimize the sample processing method for determination of water soluble organic acids in Chaenomelis Fructus by a validated HPLC-UV method. MethodsQuinic acid, malic acid, shikimic acid, protocatechuic acid, chlorogenic acid and caffeic acid were determined and used as an evaluation parameter.Single factor tests method was applied for evaluating the extraction(reflux and ultrasonic-assisted extraction), ethanol concentration and the effect of ratio of material to liquid on extraction of organic acids. The extracting solution with further purification and enrichment in mobile phase (A) employed were analyzed.ResultsThe optimum method was as follows: ratio of material to liquid 1:20 and ethanol concentration 50% with ultrasonic-assisted extraction for 60 min. Under optimal conditions, the high extraction efficiency of the organic acids in Chaenomelis Fructus was obtained with less interference from non-acidic components of the sample. A straight baseline, chromatographic peak symmetry and good resolution for the six kinds of water soluble organic acids were conducted in the chromatogram. ConclusionsThis sample processing method is effective, stable and reliable for extraction of water soluble organic acids in Chaenomelis Fructus, which can reduce the matrix effect significantly in the HPLC analysis.

Key words:Chaenomelis Fructus;organic acid;sample processing;determination;HPLC

收稿日期：(2015-08-14，修回日期：2015-11-09)

通信作者：谢晓梅，女，教授，硕士生导师，研究方向：中药质量分析研究，E-mail：xiexiaomei9401@sina.com

作者简介：况作品，男，硕士研究生

基金项目：十二五国家科技支撑计划(No 2011BAI04B06)；安徽高校省级自然科学研究项目(No KJ2012A188)；安徽中医药大学科研基金项目(No 2015zr009)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.01.015